蛋白質(zhì)技術(shù)專題：蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）
蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot ）可以：（1）從蛋白質(zhì)混合物中檢出目標(biāo)蛋白質(zhì)；（2）定量或定性確定細(xì)胞或組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)情況；（3）用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-DNA、蛋白質(zhì)-RNA相互作用后續(xù)分析。
實驗方法
- 底物化學(xué)發(fā)光ECL法
- Western印跡法
- 圖解
| 實驗方法原理 |
Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。
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| 實驗材料 |
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| 試劑、試劑盒 |
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| 儀器、耗材 |
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| 實驗步驟 |
一、試劑準(zhǔn)備
1. SDS-PAGE試劑：見聚凝膠電泳實驗。
2. 勻漿緩沖液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巰基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考馬斯亮蘭 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脫脂奶粉，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 顯色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸鎳胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。 二、蛋白樣品制備
1. 單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
（1） 倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫䞍菏箽堄嗯囵B(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。
（2） 每瓶細(xì)胞加3 ml 4℃預(yù)冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放輕輕搖動1 min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），搖勻置于冰上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時才可與裂解液混合。）
（4） 每瓶細(xì)胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動。
（5）裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 ml離心管中。（整個操作盡量在冰上進(jìn)行。）
（6）于4℃下12000 rpm離心5 min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）
（7） 將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移倒0.5 ml的離心管中放于－20℃保存。
2. 組織中總蛋白的提取
（1）將少量組織塊置于1～2 ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。
（2） 加400 μL單去污劑裂解液裂（含PMSF）于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。
（3）幾分鐘后再碾一會兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。
（4） 裂解30 min后，即可用移液器將裂解液移至1.5 ml離心管中，然后在4℃下12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
3. 加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提取
由于受藥物的影響，一些細(xì)胞脫落下來，所以除按1操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。以下是培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提�。�
（1）將培養(yǎng)液倒至15 ml離心管中，于2500 rpm離心5 min。
（2）棄上清，加入4 ml PBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500 rpm離心5 min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。
（3）用槍洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解過程中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。
（4）將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm離心5 min，取上清分裝于0.5 ml離心管中并置于－20℃保存。
三、 蛋白含量的測定
1. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
（1）從－20℃取出1 mg/ml BSA，室溫融化后，備用。
（2）取18個1.5 ml離心管，3個一組，分別標(biāo)記為0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各種試劑。
（4） 混勻后，室溫放置2 min。在生物分光光度計（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2. 檢測樣品蛋白含量
（1）取足量的1.5 ml離心管，每管加入4℃儲存的考馬斯亮藍(lán)溶液1 ml。室溫放置30 min后即可用于測蛋白。
（2） 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混勻放置2分鐘可做為空白樣品，將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。
（3）棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用無菌水洗一次。
（4）取一管考馬斯亮藍(lán)加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待測蛋白樣品，混勻后靜置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。
注意：每測一個樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次�？赏瑫r混合好多個樣品再一起測，這樣對測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時間。測得的結(jié)果是5 ml樣品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE電泳
1. 清洗玻璃板
一只手扣緊玻璃板，另一只手蘸點洗衣粉輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。
2. 灌膠與上樣
（1）玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（操作時要使兩玻璃對齊，以免漏膠。）
（2）按前面方法配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠時，可用10 ml槍吸取5 ml膠沿玻璃放出，待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。（灌膠時開始可快一些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變型。）
（3）當(dāng)水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等3 min使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
（4）按前面方法配4%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固的過程中要經(jīng)常在兩邊補(bǔ)膠。待到濃縮膠凝固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
（5）用水沖洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內(nèi)，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
（6）測完蛋白含量后，計算含50 ng蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。（上樣總體積一般不超過15 μl，加樣孔的最大限度可加20 μl樣品。）上樣前要將樣品于沸水中煮5 min使蛋白變性。
（7） 加足夠的電泳液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次，以免交叉污染。
3. 電泳
電泳時間一般4～5 h，電壓為40 V較好，也可用60 V。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
五、轉(zhuǎn)膜
1. 轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3 cm的濾紙和1張7.3～8.6 cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套，因為手上的蛋白會污染膜。將切好的硝酸纖維素膜置于水上浸2 h才可使用。（用鑷子捏住膜的一邊輕輕置于有超純水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下層才與水接觸。這樣由于毛細(xì)管作用可使整個膜浸濕。若膜沉入水里，膜與水之間形成一層空氣膜，這樣會阻止膜吸水。
2. 在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、一支玻棒、濾紙和浸過的膜。
3. 將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上），一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡。
4. 要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。（撬時一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，搟幾下就可合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行，要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇，操作時要戴手套，實驗室要開門以使空氣流通。）
5. 將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用60 V轉(zhuǎn)移2 h或40 V轉(zhuǎn)移3 h。
6. 轉(zhuǎn)完后將膜用1×麗春紅染液染5 min（于脫色搖床上搖）。然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。將膜晾干備用。
六、免疫反應(yīng)
1 . 將膜用TBS從下向上浸濕后，移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h。
2. 將一抗用TBST稀釋至適當(dāng)濃度（在1.5 ml離心管中）；撕下適當(dāng)大小的一塊兒保鮮膜鋪于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜四角以趕出殘留氣泡；室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育1～2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
七、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影
1. 將A和B兩種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，包好，放入X-光片夾中。
2. 在暗室中，將1×顯影液和定影液分別到入塑料盤中；在紅燈下取出X－光片，用切紙刀剪裁適當(dāng)大�。ū饶さ拈L和寬均需大1 cm）；打開X-光片夾，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移動，關(guān)上X-光片夾，開始計時；根據(jù)信號的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時間，一般為1 min或5 min，也可選擇不同時間多次壓片，以達(dá)最佳效果；曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時間一般為1～2 min（20～25℃），溫度過低時（低于16℃）需適當(dāng)延長顯影時間；顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時間一般為5～10 min，以膠片透明為止；用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。
應(yīng)注意的是：顯影和定影需移動膠片時，盡量拿膠片一角，手指甲不要劃傷膠片，否則會對結(jié)果產(chǎn)生影響。
八、凝膠圖象分析
將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。 |
| 注意事項 |
1. 一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定最佳條件。 2. 顯色液必須新鮮配置使用，最后加入H2O2。 3. DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。
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| 其他 |
一、免疫反應(yīng) 1. 用0.01 M PBS洗膜，5 min ×3次。 2. 加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2 h。 |
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