用T-wave離子淌度質(zhì)譜鑒定豬肌肉中多位點(diǎn)分子離子

利用T-wave離子淌度質(zhì)譜鑒定豬肌肉中的氟喹諾酮類抗生素的多位點(diǎn)分子離子及其碎片離子
Mike McCullagh1、Sara Stead¹、Jonathan Williams¹、Wouter de Keizer²和Aldert Bergwerff²

¹沃特世公司（英國(guó)曼徹斯特） ²RnAssays BV（荷蘭烏得勒支）

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
利用T-wave離子淌度產(chǎn)生的正交分離有助于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析。
■正交淌度分離技術(shù)能采集并生成復(fù)雜樣品中各個(gè)組分的MS母離子和MSE子離子譜圖。
■對(duì)于觀察到的促進(jìn)劑，可進(jìn)行再次確認(rèn)，并將其作為額外的鑒定點(diǎn)。
■使用HDMSE作為分析手段，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)室間或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)研究的差異性進(jìn)行更深入的了解。

沃特世解決方案
ACQUITY UPLC®系統(tǒng)
SYNAPT®G2-S質(zhì)譜儀
MassLynx®軟件
DriftScope™ ACQUITY UPLC BEH色譜柱

簡(jiǎn)介

氟喹諾酮是一類抗菌劑，可施用于牲畜，以達(dá)到多種目的，包括：(a)預(yù)防并控制感染；(b)促進(jìn)生長(zhǎng)。出于對(duì)抗性微生物在人類中傳播的顧慮，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）于2005年9月頒布了在牲畜生產(chǎn)中使用恩諾沙星和環(huán)丙沙星的禁令^1,2。2006年起，歐盟（EU）禁止在畜牧業(yè)中使用抗生素生長(zhǎng)促進(jìn)劑（AGP），同年，最后四種抗生素也被禁止作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑³。

雖然氟喹諾酮是一類化學(xué)性質(zhì)多樣的兩性化合物，但這些化合物都具有4-喹諾酮環(huán)基本結(jié)構(gòu)。為了增強(qiáng)其抗菌能力和藥代動(dòng)力學(xué)特性，已進(jìn)行了多種改性嘗試，包括在喹諾酮環(huán)（苯并吡喃酮核）四周引入不同的官能團(tuán)。氟喹諾酮在其雙環(huán)結(jié)構(gòu)的6位上帶有一個(gè)氟原子（圖1），表現(xiàn)出廣譜抗菌活性。目前，規(guī)定了八種（氟）-喹諾酮類化合物的歐盟最大殘留量（MRL），根據(jù)種類和組織類型的不同，限量范圍在10至1900 µg kg-1之間⁴。

實(shí)驗(yàn)

提取準(zhǔn)備
用于此次研究的豬肌肉組織提取物由RnAssays慷慨提供。簡(jiǎn)單來講，在提取前根據(jù)相關(guān)的歐盟最大殘留量濃度要求，在已知的空白豬肌肉添加25種不同的抗菌化合物（來自于氟喹諾酮、四環(huán)素和酰胺醇類），將其在水/有機(jī)提取溶劑中，機(jī)械研磨成勻漿，然后進(jìn)行離心操作。取上清液，并置于自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶中進(jìn)行后續(xù)的LC/MS分析。

UPLC條件
系統(tǒng)：  ACQUITY UPLC
色譜柱：  ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm， 50 × 2.1 mm
柱溫：  40 ℃
流速：  0.6 mL/min
流動(dòng)相A：  水（0.1%甲酸）
流動(dòng)相B：  乙腈（0.1%甲酸）
進(jìn)樣體積：  10 μL

MS條件
質(zhì)譜儀：  SYNAPT G2-S
電離模式：  2.0 kV ESI+
錐孔電壓：  25 V
脫溶劑氣溫度：  550 ℃
參比質(zhì)量數(shù)：  亮氨酸腦啡肽，[M+H]⁺=556.2771
采集范圍：  50-1200 m/z
采集速率：  4光譜/秒
碰撞能量：  15-45 eV
分辨率：  20,000 FWHM 
IMS T-Wave速度：  550 m/s
IMS T-Wave脈沖高度：  40 V
緩沖氣體：  N₂和CO₂

氟喹諾酮?dú)埩舴治龅牡湫筒襟E是：首先進(jìn)行溶劑萃取，然后進(jìn)行固相萃�。⊿PE）純化，并通過LC分離，結(jié)合UV檢測(cè)，熒光（FL）或質(zhì)譜（MS）檢測(cè)。這些方法通常只能檢測(cè)少量目標(biāo)分析物，并且樣品通量較低⁵。許多不同種類的質(zhì)量分析儀常被用于獸藥殘留（VDR）分析，包括單四極桿、串聯(lián)四極桿、離子阱以及最近的基于飛行時(shí)間（Tof）的技術(shù)^6,7,8。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀取代單級(jí)質(zhì)譜用于定量分析現(xiàn)已得到廣泛的接受，因?yàn)樗�在選擇性和靈敏度方面可提供卓越的性能優(yōu)勢(shì)。這得益于多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式，在該模式下，首先使用第一個(gè)四極桿進(jìn)行母離子的質(zhì)量數(shù)選擇，當(dāng)選擇特定母離子的質(zhì)量數(shù)后，進(jìn)入碰撞室碎裂，最后用第二個(gè)四極桿檢測(cè)。即便采用這種方法，其它與分析物無關(guān)的化合物仍有一小部分會(huì)產(chǎn)生干擾信號(hào)。出于這個(gè)原因，會(huì)對(duì)第二對(duì)MRM離子對(duì)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。只有樣品中，兩對(duì)離子對(duì)的MRM都產(chǎn)生了色譜峰并且色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)化合物的一致，才能確定該樣品存在該化合物。另外，這兩個(gè)MRM峰的強(qiáng)度比率也必須與純標(biāo)準(zhǔn)品的相同。此方法已經(jīng)在歐盟指令（2002/657/EEC）中進(jìn)一步細(xì)化，該指令規(guī)定了對(duì)用于定量和確定食品和動(dòng)物飼料中獸藥殘留的分析方法的要求⁹。

串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀廣泛用于需要在復(fù)雜基質(zhì)中，需要高靈敏檢測(cè)（通常濃度為較低的μg kg-1值）的殘留監(jiān)測(cè)項(xiàng)目。當(dāng)選擇新的基于串聯(lián)四極桿的方法，以進(jìn)行獸藥殘留分析時(shí)，對(duì)MRM通道的選擇十分關(guān)鍵，必須按照上文所述2002/657/EC指導(dǎo)原則進(jìn)行選擇和驗(yàn)證。

本應(yīng)用紀(jì)要探索了使用High Definition Mass Spectrometry^TM（HDMS^TM）作為重要的方法開發(fā)工具，用于支持組織粗提取物中氟喹諾酮抗生素的明確鑒定。使用HDMS分析豬肌肉組織的粗提取物，以確定是否存在包括氟喹諾酮類在內(nèi)的抗生素殘留。該技術(shù)對(duì)于分析復(fù)雜基質(zhì)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它結(jié)合了高分辨率質(zhì)譜與基于離子淌度的高效分離方法。離子淌度光譜法（IMS）是一種快速的正交氣相分離技術(shù)，能在LC分離時(shí)間允許范圍內(nèi)，獲得另一個(gè)維度的分離。它是根據(jù)化合物的大小、形狀和電荷，對(duì)化合物進(jìn)行區(qū)分的。另外，在HDMS實(shí)驗(yàn)中，單次進(jìn)樣就能獲得母離子及其碎片離子信息，稱為HDMS^E。

結(jié)果與討論
使用通用梯度條件，測(cè)得抗生素環(huán)丙沙星在保留時(shí)間2.19分鐘時(shí)洗脫，如圖3所示（圖3為基峰離子色譜圖）。

圖4所示為使用MassLynx軟件所得的常規(guī)精確質(zhì)量數(shù)譜圖，其中觀察到：在m/z為332.1410時(shí)，[M+H]+離子的精確質(zhì)量數(shù)測(cè)量誤差為0 ppm。通過獲得的精確質(zhì)量數(shù)測(cè)量結(jié)果與使用MassLynx中的元素組成計(jì)算工具，得到其元素組成，能使我們可靠地鑒定2.19分鐘的色譜峰。

圖3和圖4的常規(guī)數(shù)據(jù)說明所分析的氟喹諾酮為單一組分。然而，使用離子淌度分析發(fā)現(xiàn)，氟喹諾酮是由兩種離子化物質(zhì)組成，如圖5和圖6所示。盡管這兩個(gè)組分只是質(zhì)子化位點(diǎn)不同，但是，在使用離子淌度對(duì)環(huán)丙沙星的分析中，分離相差了1.14毫秒。淌度分離可使用圖5中的DriftScope查看，圖5為獸藥標(biāo)準(zhǔn)品混合物的漂移時(shí)間與保留時(shí)間變化圖。圖5顯示出分析的所有氟喹諾酮標(biāo)準(zhǔn)品的漂移時(shí)間分離以及獲得的離子強(qiáng)度。還突出顯示了環(huán)丙沙星的離子對(duì)強(qiáng)度。圖6顯示了這對(duì)離子的更多具體數(shù)據(jù)，其中突出顯示了相應(yīng)的酸/堿基團(tuán)質(zhì)子化位點(diǎn)和漂移時(shí)間¹⁰。

因此，每種促進(jìn)劑都被視為單一組分，以獲得各自的碎片譜圖（圖7）。從單一組分MSE碎片譜圖中，可測(cè)定出環(huán)丙沙星酸性和堿性基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化而產(chǎn)生的兩種淌度分離的物質(zhì)。實(shí)際上，m/z 314和m/z 231的碎片離子（圖7）是由酸性基團(tuán)發(fā)生離子化的環(huán)丙沙星產(chǎn)生的。而m/z 288和m/z 245碎片離子只是由堿性基團(tuán)質(zhì)子化的環(huán)丙沙星產(chǎn)生的。據(jù)觀察，兩種促進(jìn)劑均能形成m/z 231碎片離子。有關(guān)碎片離子的進(jìn)一步研究已經(jīng)完成，將在另一篇文章中進(jìn)行介紹。

在圖4中，顯示了UPLC HDMS^E實(shí)驗(yàn)生成的常規(guī)MS譜圖。在m/z 157和m/z 166處，清楚顯示環(huán)丙沙星存在兩個(gè)小的雙電荷離子，表明環(huán)丙沙星確實(shí)形成了一種雙電荷物質(zhì)。使用離子淌度能夠?qū)崿F(xiàn)分離并確認(rèn)該小分子形成了雙電荷物質(zhì)。雙電荷物質(zhì)的形成與否，取決于使用的MS參數(shù)，尤其是錐孔電壓。如果錐孔電壓過高，則無法觀察到雙電荷物質(zhì)，僅能觀察到[M+H]⁺。

所得數(shù)據(jù)表明：應(yīng)當(dāng)仔細(xì)考慮方法開發(fā)和所選的分析方法，因?yàn)榇龠M(jìn)劑的比例和形成會(huì)根據(jù)洗脫液流速、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和基質(zhì)的不同而發(fā)生變化。如果選擇了MRM方法，則需要考慮使用的實(shí)驗(yàn)條件和所選擇的具體質(zhì)譜通道。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：選擇的MRM離子對(duì)如果不一致，容易在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和不同實(shí)驗(yàn)室間產(chǎn)生偏差，闡述了保持這些化合物可重現(xiàn)性結(jié)果，遇到的挑戰(zhàn)。離子淌度是一種可用于方法開發(fā)的強(qiáng)大工具，能夠確保方法的可靠性并獲得一致結(jié)果。

除了更加具體和可靠的方法開發(fā)，不同組分的不同漂移時(shí)間，可作為另一個(gè)鑒別條件。本應(yīng)用紀(jì)要介紹了可用作環(huán)丙沙星鑒定條件的保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)、碎片離子精確質(zhì)量數(shù)和兩個(gè)漂移時(shí)間。

除了利用離子淌度獲得一個(gè)新的鑒定條件，還可將離子淌度產(chǎn)生的正交分離用于譜圖清理。漂移時(shí)間與保留時(shí)間變化圖（圖8A）顯示了離子強(qiáng)度，用白色像素表示�；�質(zhì)離子的存在范圍用連續(xù)的白色表示。更大強(qiáng)度的分析物和基質(zhì)組分由更明顯的白點(diǎn)表示。但是由于基質(zhì)產(chǎn)生了大量的離子強(qiáng)度，所以很難觀察到低濃度的目標(biāo)分析物。在圖8B中，從豬基質(zhì)中提取出了環(huán)丙沙星促進(jìn)劑。根據(jù)使用離子淌度所得到的清晰、選擇性的分離，可產(chǎn)生單一組分的MS及其碎片離子譜圖。在這些條件下，豬基質(zhì)中的酸性位點(diǎn)促進(jìn)劑與堿性位點(diǎn)促進(jìn)劑的比例測(cè)定為5:1。這受到了毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、電極位置、流速和基質(zhì)的影響。在注射實(shí)驗(yàn)中，可以改變酸/堿促進(jìn)劑的比例，甚至可改變含量最高的促進(jìn)劑。

圖9和10顯示了環(huán)丙沙星、諾氟沙星和二氟沙星促進(jìn)劑的到達(dá)時(shí)間分布以及分別使用氮?dú)夂投�氧化碳作為緩沖氣體時(shí)得到的峰間分離度計(jì)算結(jié)果。雖然兩種氣體都獲得了可接受的分離度，但是峰間的Rs值大于1.5才可視為完全分離。先前的研究認(rèn)為：交替使用這兩種緩沖氣體，可增加離子淌度的分離度^10-14。

在執(zhí)行IMS時(shí)，離子分離在T Wave離子淌度（TWIM）漂移管中進(jìn)行，分離結(jié)果由電荷態(tài)、質(zhì)量數(shù)、形狀、緩沖氣體極化率以及離子與中性氣體分子間的相互作用決定。在該應(yīng)用中，增加緩沖氣體的極化率，能增加TWIM的分離能力（峰容量）。因此，通過充分考慮所使用的緩沖氣體的極化率，可使峰與峰之間的分離度得到提高，在本研究中，使用的是二氧化碳。使用氮?dú)饣蚨�氧化碳時(shí)獲得的峰間分離度（Rs=1.18(ta-tb)/W0.5,a+W0.5,b）匯總于表1中（其中Rs表示計(jì)算得到的分離度，W0.5a和W0.5b分別表示峰A和峰B的半高峰寬，ta和tb分別為峰A和峰B的漂移時(shí)間）。可以看到，當(dāng)使用二氧化碳作為離子淌度緩沖氣體時(shí)，所有氟喹諾酮促進(jìn)劑對(duì)均完全分離，峰間分離度介于2.61和4.13之間。使用二氧化碳所增加的峰容量進(jìn)一步提升了單一組分母離子及其相應(yīng)的單一組分碎片離子譜圖的質(zhì)量。

結(jié)論
基于對(duì)本研究中氟喹諾酮化合物的特征離子化的觀察，使用UPLC IMS MS^E進(jìn)行方法開發(fā)是合理的。
  ■ 使用離子淌度，可將同一分子，不同質(zhì)子化物質(zhì)實(shí)現(xiàn)神奇的分離。
  ■ 顯示并鑒別了同分子，不同位點(diǎn)質(zhì)子化合物的碎片譜圖。
  ■ 得到每個(gè)組分的母離子MS及其MS^E碎片譜圖
  ■ HDMS^E觀察結(jié)果可以解釋在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)監(jiān)測(cè)特定MRM離子隊(duì)獲得的研究對(duì)象報(bào)告結(jié)果有時(shí) 會(huì)出現(xiàn)差異的原因。
  ■ 漂移時(shí)間值可作為保留時(shí)間、母離子精確質(zhì)量數(shù)和碎片精確質(zhì)量數(shù)譜圖之外的又一個(gè)鑒定條件。
  ■ 離子淌度分離可以有效地將目標(biāo)峰從基質(zhì)干擾中分離出來，而不需要對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行純化及色譜分離。

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