應(yīng)用四極桿離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析

高清晰數(shù)據(jù)直接分析：應(yīng)用四極桿離子淌度飛行時(shí)間質(zhì)譜進(jìn)行非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析
Keith Richardson¹ , Christopher J. Hughes¹ , Arkadiusz Grzyb¹ , Dominic Helm² , Bernhard Kuster² , Jason Wildgoose¹ 

¹沃特世公司 （英國(guó)曼徹斯特） 
²慕尼黑理工大學(xué) （德國(guó)弗賴辛）

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

  ■ 改善蛋白質(zhì)識(shí)別，增加蛋白質(zhì)組覆蓋范圍

  ■ 即使在極低濃度下也能實(shí)現(xiàn)可靠鑒定

  ■ 更有效地進(jìn)行LC/MS/MS分析從而加快決策過(guò)程

簡(jiǎn)介
隨著自下而上（bottom-up）蛋白質(zhì)組學(xué)分析的復(fù)雜性不斷增加，對(duì)于質(zhì)譜儀的能力提出了挑戰(zhàn)，其需要生成更多的詳細(xì)信息才能滿足用戶的需要。近年來(lái)，質(zhì)譜儀的速度、靈敏度和質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確性都有了顯著的提高，可獲得更好的數(shù)據(jù)質(zhì)量、改善的肽序列標(biāo)注以及更準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

隨著硬件性能的改善，我們開(kāi)發(fā)出一系列新型LC/MS采集方案和碎裂機(jī)制，包括母離子發(fā)現(xiàn)（PID）方法、非信息依賴型采集（DIA）、離子淌度（IM）輔助方法以及電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）。目前，IM主要應(yīng)用于多種類(lèi)型分析物的截面分析和結(jié)構(gòu)分析¹，可增強(qiáng)DIA采集的特異性，例如HDMS^E。²

本研究中展示了一種新型的高清晰數(shù)據(jù)采集 （HD-DDA）模式在蛋白質(zhì)和肽鑒定中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，該模式將離子淌度法結(jié)合到四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中。HD-DDA采用一種高工作周期模式，有利于決策的制定，可實(shí)現(xiàn)高靈敏度和選擇性的實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)
使用胰蛋白酶酶切大腸桿菌和海拉細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)容物。將溶解產(chǎn)物注入nanoACQUITY UPLC系統(tǒng)中，該系統(tǒng)配有ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm，15 cm × 75 μm色譜柱并連接SYNAPT G2-Si質(zhì)譜儀。采用ProteinLynx Global SERVER和/或Mascot對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和搜索³。

結(jié)果與討論
HD-DDA的改進(jìn)包括全面支持寬帶增強(qiáng)⁴，這可使信號(hào)提高5至10倍，并增強(qiáng)了決策制定邏輯，還可在MS和MS/MS模式之間切換。寬帶增強(qiáng)利用離子淌度分離單電荷態(tài)的產(chǎn)物離子，并結(jié)合推斥極同步以實(shí)現(xiàn)接近100%的工作周期，如圖1所示。

HD-DDA采集通常在非靶向模式下進(jìn)行，可以由無(wú)限制的目標(biāo)和/或排除列表進(jìn)行補(bǔ)充。碰撞能量可以是階梯式的、傾斜的或基于m/z和電荷態(tài)實(shí)時(shí)確定。數(shù)據(jù)可通過(guò)ProteinLynx Global SERVER或分別使用供應(yīng)商中立的搜索算法和驗(yàn)證工具進(jìn)行處理和搜索，例如Mascot和Scaffold⁵。

圖2中證實(shí)了寬帶增強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。其中，大腸桿菌胰蛋白酶消化物通過(guò)納升LC/MS/MC進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采集分別采用常規(guī)DDA和HD-DDA。在這兩種情況下，均選取了LC峰內(nèi)相同時(shí)間的0.1秒MS/MS數(shù)據(jù)。在該實(shí)驗(yàn)中，將整個(gè)MS/MS譜圖進(jìn)行平均后發(fā)現(xiàn)，信號(hào)增強(qiáng)了5倍。

在該實(shí)驗(yàn)中，每次調(diào)查掃描執(zhí)行15次并行MS/MS實(shí)驗(yàn)。如圖3所示，結(jié)果表明將DDA與HD-DDA對(duì)比時(shí)，MS/MS總離子流（TIC）的增加與MS/MS通道數(shù)呈函數(shù)關(guān)系。每次運(yùn)行的平均增加量為420%，與圖2中所示結(jié)果一致。插圖是15次MS/MS通道的示例，證明了可從樣品中存在的較低豐度的肽中輕松獲取具有良好信噪比的MS/MS數(shù)據(jù)。

圖4中顯示了采用HD-DDA對(duì)相同的大腸桿菌樣品進(jìn)行自下而上的LC/MS蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)可增加靈敏度。A圖展示了肽序列匹配數(shù)量的增加。B圖中的維恩相交圖將蛋白質(zhì)鑒定數(shù)量進(jìn)行了對(duì)比。從中可觀察到鑒定的肽數(shù)量（34.8%）和蛋白質(zhì)數(shù)量（42.8%）均有顯著增加。

圖5顯示了一個(gè)更具挑戰(zhàn)性的樣品的搜索結(jié)果。此處匯總了海拉細(xì)胞胰蛋白酶消化物分析的PLGS搜索結(jié)果。總共有2200多種蛋白質(zhì)被鑒定為超過(guò)95%的鑒定置信度閾值。在該實(shí)驗(yàn)中，譜圖鑒定率為38%。

結(jié)論

  ■ HD-DDA寬帶增強(qiáng)通常可使信號(hào)增強(qiáng)5至10倍

  ■ 低豐度物質(zhì)/肽的譜圖數(shù)據(jù)質(zhì)量得到顯著提升

  ■ MS/MS譜圖獲得正確匹配的比例大大增加

  ■ HD-DDA數(shù)據(jù)的鑒定數(shù)量增加是靈敏度提高和譜圖質(zhì)量改善的直接結(jié)果

參考文獻(xiàn) 
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2.  Rodriguez-Suarez  E, Hughes C, Gethings  L, Giles K, Wildgoose  J, Stapels M,  Fadgen K, Geromanos SJ, Vissers JPC,  Elortza  F,  Langridge JI. An  Ion Mobility Assisted Data  Independent  LC-MS  Strategy  for  the Analysis of Complex Biological Samples. Current  Anal Chem. 2013 April; 9(2):199-211.
3.  Perkins DN, Pappin DJ, Creasy DM, Cottrell JS. Probability-based  protein identi?cation by searching sequence databases using mass  spectrometry data. Electrophoresis. 1999 Dec; 20(18):3551-67.
4.  Wildgoose, et. al. A comparison of methods of improving the duty  cycle on orthogonal TOF mass analyzers. ASMS 2005.
5.  Searle BC. Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based  proteomic studies. Proteomics. 2010 Mar; 10(6):1265-9.

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