實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類以及實驗步驟介紹

實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）技術（Real-time quantitative PCR），是指在（QPCR，熒光定量）反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個（QPCR，熒光定量）PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）它具有特異性更強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，已成為國際公認的核酸分子定量的標準方法，目前（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）在基因表達研究和臨床疾病檢測等領域已得到廣泛應用（如轉基因動植物檢測、RNAi基因失活率檢測、病原微生物或病毒含量檢測、基因差異表達、基因分型）。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR，QPCR，熒光定量）對DNA/RNA 進行實時熒光定量PCR（Real-time PCR） 的定量測定或型的鑒定。
實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）分類：

☆TaqMan熒光探針（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）
    PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

☆SYBR Green熒光染料法：Real-time PCR|QPCR
    SYBR Green是一種DNA結合染料，能非特異地摻入到雙鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。在Real-time PCR|QPCR實驗中它的最大優(yōu)點就是可以與任意引物、模板相配合，用于任意反應體系中。從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的Real-time PCR|QPCR價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結合，所以一旦反應體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結果的可靠性與重復性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應條件以消除非特異性影響。

客戶提供
（1）Real-time PCR|QPCR基因信息
（2）Real-time PCR|QPCR實驗前盡可能新鮮和足夠量的組織（≧100mg）、細胞樣品（10  ）或血清，或直接提供純化好的總RAN（≧1ug）
  歷經(jīng)10多年的發(fā)展，實時熒光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，熒光定量）已經(jīng)由最初的簡單定性發(fā)展到現(xiàn)在的Real-time PCR|QPCR，可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，準確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。技術的成熟，為其廣泛的應用奠定了基礎。
威斯騰生物|實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR|服務內(nèi)容
（1）根據(jù)Real-time PCR|QPCR目的基因設計引物及引物合成
（2）RNA抽提+逆轉錄
（3）RNA定量及質(zhì)量分析
（4）使用熒光染料SYBR Green法進行Real-time PCR|QPCR（重復三次）
（5）數(shù)據(jù)處理
實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR的原始數(shù)據(jù)。擴增產(chǎn)物有良好的熔解曲線，可靠的重復性
②實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR 標準實驗流程報告
③實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR實驗結果檢測報告。

●主要實驗步驟如下： 

實時熒光定量PCR（Real-time PCR）是由三個步驟組成:
1.反轉錄:依賴反轉錄酶將RNA反轉錄成cDNDA;
2.擴增:用PCR的方法擴增cDNA;
3.檢測:實時檢測和定量擴增的產(chǎn)物.

實時熒光定量PCR|Real-time PCR|QPCR中的一些術語

1 CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應的循環(huán)次數(shù)。

2 閾值：閾值的默認設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。

3 CT值與起始模板的量成線性關系。