細(xì)胞凋亡（TUNEL，TUNEL染色）檢測技術(shù)簡介

細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，  生物體內(nèi)細(xì)胞在特定的內(nèi)源或外源信號(hào)誘導(dǎo)下，其死亡途徑被激活，并在有關(guān)基因的調(diào)控下發(fā)生的程序性死亡過程。細(xì)胞凋亡是程序性死亡過程的一種主要形式，它涉及染色質(zhì)凝聚和外周化、細(xì)胞質(zhì)減少、核片段化、細(xì)胞質(zhì)致密化、與周圍細(xì)胞聯(lián)系中斷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與細(xì)胞膜融合，最終細(xì)胞片段化形成許多細(xì)胞凋亡體。

細(xì)胞凋亡用（TUNEL，TUNEL染色）（TdT-mediated dUTP nick end labeling）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒來檢測。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。細(xì)胞凋亡檢測其原理是熒光素標(biāo)記的12-dUTP在末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶(TdT)的作用下，連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3’-OH末端，利用由熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞檢測儀檢測凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，細(xì)胞凋亡不是一件被動(dòng)的過程，而是主動(dòng)過程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理?xiàng)l件下，自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中起著必要的作用。它在生物體的進(jìn)化、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定以及多個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育中起著重要的作用。細(xì)胞凋亡不僅是一種特殊的細(xì)胞死亡類型，而且具有重要的生物學(xué)意義及復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。

根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開來。細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。 

一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測

根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。

1 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡：
（1） 未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡拍細(xì)（胞凋亡）結(jié)果：

一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與　DNA的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在DNA的A-T堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時(shí)發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

Hoechst是與DNA特異結(jié)合的活性染料，儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時(shí)用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。

DAPI為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲(chǔ)存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。

結(jié)果評(píng)判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

3 透射電子顯微鏡觀察|細(xì)胞凋亡：
結(jié)果評(píng)判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。細(xì)胞凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu)；細(xì)胞凋亡Ⅱa期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin V法）檢測|細(xì)胞凋亡：

Annexin V/PI雙染檢測|細(xì)胞凋亡：

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。因此 Annexin V 被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

Annexin V/PI檢測|細(xì)胞凋亡|優(yōu)勢：和其他凋亡檢測方法相比，Annexin V/PI雙染可以輕

松區(qū)分細(xì)胞凋亡和壞死，并在凋亡早期進(jìn)行檢測，靈敏度高。