細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡通路和細(xì)胞凋亡檢測(cè)的幾種檢測(cè)方法

一、形態(tài)學(xué)觀察方法

1、HE染色、光鏡觀察：細(xì)胞凋亡后呈圓形，胞核深染，胞質(zhì)濃縮，染色質(zhì)成團(tuán)塊狀，細(xì)胞表面有“出芽”現(xiàn)象。

2、丫啶橙(AO)染色，熒光顯微鏡觀察：活細(xì)胞核呈黃綠色熒光，胞質(zhì)呈紅色熒光。細(xì)胞凋亡|后（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè)，可見(jiàn)細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。

3、臺(tái)盼藍(lán)染色：（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）：如果細(xì)胞膜不完整、破裂，臺(tái)盼藍(lán)染料進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞變藍(lán)，即為壞死。如果細(xì)胞膜完整，細(xì)胞不為臺(tái)盼藍(lán)染色，則為正常細(xì)胞或凋亡細(xì)胞。此方法對(duì)反映細(xì)胞膜的完整性，區(qū)別壞死細(xì)胞有一定的幫助。

4、透射電鏡觀察：（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）：可見(jiàn)凋亡細(xì)胞表面微絨毛消失，核染色質(zhì)固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細(xì)胞吞噬現(xiàn)象。

二、dna凝膠電泳

(一)、檢測(cè)原理（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）

細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死，其細(xì)胞DNA均發(fā)生斷裂，細(xì)胞內(nèi)小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA片斷。但細(xì)胞凋亡后DNA斷裂點(diǎn)均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間，出現(xiàn)180-200bpDNA片斷，而壞死細(xì)胞的DNA斷裂點(diǎn)為無(wú)特征的雜亂片斷，利用此特征可以確定群體細(xì)胞的死亡，并可與壞死細(xì)胞區(qū)別。

(二) 細(xì)胞凋亡，結(jié)果判斷

正常活細(xì)胞DNA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶; （細(xì)胞凋亡）后，壞死細(xì)胞DNA電泳類似血抹片時(shí)的連續(xù)性條帶。

三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測(cè)定（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）

細(xì)胞凋亡的DNA斷裂使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測(cè)，細(xì)胞凋亡。

(一) （細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）檢測(cè)步驟

1、細(xì)胞凋亡后，將其裂解后高速離心，其上清液中含有核小體

2、在微定量板上吸附組蛋白體

3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合

4、加辣過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合

4、加酶的底物，測(cè)光吸收制。

(二) （細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）用途

該法敏感性高，可檢測(cè)5*100/ml個(gè)凋亡細(xì)胞�？捎糜谌�、大鼠、小鼠的（細(xì)胞凋亡）檢測(cè)。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測(cè)定細(xì)胞凋亡發(fā)生的絕多對(duì)量。

四、流式細(xì)胞儀定量分析（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）

(一) （細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）檢測(cè)原理

細(xì)胞凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常細(xì)胞與壞死細(xì)胞之間。利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀測(cè)量細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞核凋亡細(xì)胞。

(二) （細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)）應(yīng)用價(jià)值

流式細(xì)胞儀檢測(cè)具有以下特點(diǎn)：

1)、檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)量大，因此其反映群體細(xì)胞凋亡狀態(tài)比較準(zhǔn)確

2)、可以做許多相關(guān)性分析

3)、結(jié)合被檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量的分析，可確定細(xì)胞凋亡所處的細(xì)胞周期

檢測(cè)形態(tài)學(xué)及細(xì)胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法檢測(cè)（細(xì)胞凋亡）

細(xì)胞凋亡時(shí)，其細(xì)胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞之間，利用這一特點(diǎn)，被檢測(cè)細(xì)胞懸液用熒光素染色，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞熒光強(qiáng)度來(lái)區(qū)分正常細(xì)胞、壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

利用Hoechs-PI染色法，正常細(xì)胞對(duì)染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細(xì)胞主要攝取Hoecha染料，呈現(xiàn)強(qiáng)藍(lán)色熒光，而壞死細(xì)胞主要攝取碘化丙啶(PI)而呈強(qiáng)的紅色熒光。

DNA片斷原位標(biāo)記法

細(xì)胞凋亡后DNA片斷原位末端檢測(cè)技術(shù)是指在細(xì)胞(或組織)結(jié)構(gòu)保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標(biāo)記的脫氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate，DUTP)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)相反應(yīng)與凋亡細(xì)胞裂解后3·的羥基(-OH)端結(jié)合，經(jīng)顯色反應(yīng)后檢測(cè)DNA裂解點(diǎn)的技術(shù)。

DNA片段原位標(biāo)記法檢測(cè)（細(xì)胞凋亡）有二種：

1、原位缺口轉(zhuǎn)移(in situ nick-translation,ISNT)技術(shù)，它是利用DNA多聚酶I將標(biāo)記的核苷酸連接到斷裂DNA的3·-OH端

2、原位缺口末端標(biāo)記技術(shù)(in situ end labelling technique,ISEL)，即TUNEL法檢測(cè)（細(xì)胞凋亡,細(xì)胞凋亡通路，細(xì)胞凋亡檢測(cè)），它是利用TdT將標(biāo)記的DUPT接到3·-OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠(yuǎn)高于ISNT，尤其對(duì)早期細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，TUNEL更為合適。

檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化的Annexin V 聯(lián)合PI法

1、TUNEL檢測(cè)（細(xì)胞凋亡）原理：在細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至細(xì)胞膜外測(cè)。磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，它于PS具有高度的結(jié)合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞外測(cè)的磷脂酰絲氨酸。故利用對(duì)PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標(biāo)記上熒光素(如異硫氰酸熒光素FITC)，同時(shí)結(jié)合使用PI拒染法(因壞死細(xì)胞PS亦暴露于細(xì)胞膜外測(cè)，且對(duì)PI高染)進(jìn)行凋亡細(xì)胞雙染法后用流式細(xì)胞儀即可檢測(cè)凋亡細(xì)胞。

2、TUNEL檢測(cè)（細(xì)胞凋亡）結(jié)果判斷：正常活細(xì)胞Annexin V 、PI均低染;凋亡細(xì)胞Annexin V高染、PI低染;壞死細(xì)胞Annexin V/PI均高染。

3、TUNEL檢測(cè)（細(xì)胞凋亡）應(yīng)用價(jià)值：細(xì)胞凋亡時(shí)，膜上的PS外露早于DNA斷裂發(fā)生，因此Annexin V聯(lián)合PI染色法檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯(lián)合PI染色不需固定細(xì)胞，可避免PI染色因固定造成的細(xì)胞碎片過(guò)多及TUNEL法因固定出現(xiàn)的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯(lián)合PI法更加省時(shí)，結(jié)果更為可靠，是目前最為理想的檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。