細胞技術(shù)專題：小鼠腹腔巨噬細胞原代培養(yǎng)實驗

一、實驗材料準備
 

1.   動物：各個品系的小鼠2-4只。
 

2.  試劑：RPMI1640培養(yǎng)基(含酚紅)，小牛血清，雙抗，培養(yǎng)液(10%小牛血清、RPMI1640、雙抗)，臺盼蘭等。碘酒綿球和酒精綿球。
 

3.  器械：一次性注射器、手術(shù)器械。
 

二、實驗方法
 

如果采用刺激物，則可在實驗前三天腹腔注射3%巰基乙醇酸鈉每只2 mL，獲得的巨噬細胞數(shù)要多一些。不采用刺激物，直接開始下面的步驟。
 

1.  拉頸處死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分鐘，移入超凈臺中，仰臥位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮膚，酒精綿球脫碘。用手術(shù)直剪充分剪開腹部皮膚，暴露腹部肌層，再用酒精綿球消毒腹部肌層。
 

2.   用注射器抽取5 mL含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基注入腹腔，用綿球輕揉腹部1-2 min，然后，用眼科鑷稍提起腹腔，并用眼科剪剪開一個小口，用吸管吸取細胞懸液，移入離心管中(個人認為，此法比用注射器抽吸好一些)。
 

3.  1 000 rpm離心5 min后，用含雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基洗滌一次，再次離心，重懸細胞于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，則選擇相應(yīng)的培養(yǎng)液。臺盼藍拒染法計數(shù)，將細胞稀釋到目的濃度后，接種即可。
 

4.  如果是作為飼養(yǎng)細胞使用，調(diào)整濃度至2x10⁵個/mL，接種到96孔板中，每孔100-200 μL；如果作為其它實驗使用，可以調(diào)整成2x10⁶/mL，加到24孔平底培養(yǎng)板中，1 mL/孔；5% CO₂溫箱孵育2 h后，換液，并用RPMI1640培養(yǎng)基洗1-2次，棄去未粘附細胞，貼壁細胞為單層的巨噬細胞。
 

三、 結(jié)果
 

巨噬細胞剛貼壁時偏圓形，或者類似鵝卵石形狀，然后慢慢伸出偽足，鋪開呈三角形或多角形。巨噬細胞有吞噬的特性，當與細菌混合在一起的時候，在40倍物鏡下可以看到巨噬細胞吞噬細菌，因此，巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞可以清除部分污染的細菌、支原體和部分細胞碎片。