細胞技術專題：原代胚胎成纖維細胞培養(yǎng)

實驗器材

手術小直剪刀三把、眼科直鑷子三把、眼科彎鑷子兩把、玻璃平 皿三套、200目尼龍濾網、50ML、15ML離心管和手術刀片。以上物品均需要高壓滅菌消毒處理。

實驗試劑

無Ca²⁺和Mg²⁺的 PBS、0.05%胰酶0.53mmol/L EDTA溶液、小鼠胚成纖維細胞（MEF）生長培養(yǎng)基：高糖DMEM加10%FCS。

實驗動物

孕期14至16天的孕鼠

實驗步驟

1. 處死孕鼠，置于75%酒精里全身浸泡，然后在超凈臺中用一把剪刀和一把鑷子把孕鼠外皮剪開，用另外一把剪刀和一把鑷子把內皮剪開，露出子宮，最后用第三把剪刀和鑷子將子宮小心取出放在盛有PBS的玻璃平皿中，沖洗去血。

2.用兩把彎鑷子將胚胎外的胞膜小心去除，然后夾掉頭和內臟，將其余胚胎轉移到一個裝有30MLPBS的50ML離心管中，輕輕顛倒兩次，倒掉PBS，再重復此步驟一次，留少許PBS將胚胎轉移到另一裝有PBS的平皿中，用手術刀片將其細細切碎。

3.用200ul的移液槍反復快速吹打平皿中的液體，放在15ML離心管中，4℃1500rpm離心5分鐘，倒掉上清，加10ML胰酶，重懸沉淀，放37℃水浴中消化30分鐘，且每隔五分鐘輕輕晃動，使之充分消化。

4.將上層細胞懸液倒入一裝有 10MLMEF生長培養(yǎng)基的50ML離心管中，用200目尼龍濾網過濾后，1500rpm離心5分鐘收集細胞。30ML　MEF生長培養(yǎng)基洗滌兩次（此步驟中作者試過用無血清的培養(yǎng)基洗滌，結果無差別）。

5.細胞沉淀用15ML生長培養(yǎng)基懸起，細胞計數(shù)（八只14天胎鼠可獲得2-3×10⁷細胞）。

6.3×10⁶細胞懸浮于15ML MEF生長培養(yǎng)基中，接種到200ML的培養(yǎng)瓶中。

7.24小時后更換新鮮的MEF生長培養(yǎng)基。

8.細胞長滿后，先用PBS沖洗，倒掉，加胰酶消化（此步時間不宜過長，作者一般不超過五分鐘），按1：5傳代。

9.細胞再次長到覆蓋率80-90%左右，將其消化后，常規(guī)凍存。（凍存液要現(xiàn)配）

五、討論

1.原代培養(yǎng)，一定要避免污染。

2. MEF生存能力有限，如果不凍存，體外存活十代左右。

3. 凍存后復蘇的細胞只能傳代一次，因為這些細胞繁殖能力有限。

4. 消化細胞時間不要過長。