RT2 Profiler PCR Arrays新手小技巧及注意事項(xiàng)

RNA純化和分析:

起始RNA樣品的質(zhì)量是成功實(shí)驗(yàn)的最重要的因素之一。我強(qiáng)烈推薦使用QIAGEN的RNA純化試劑盒來進(jìn)行RNA純化。RNA樣品必須進(jìn)行柱上DNase處理，以保證你的RNA的純度。假如你的樣品很特別，需要選擇一個(gè)最合適的試劑盒進(jìn)行純化，請(qǐng)致電或e-mail聯(lián)系QIAGEN技術(shù)人員，他們很樂意幫您選擇一個(gè)合適的試劑盒。

確保RNA樣品適合進(jìn)行PCR array。RNA樣品進(jìn)行PCR array實(shí)驗(yàn)前必須先通過吸光值的測(cè)定來檢驗(yàn)RNA的濃度和純度，并通過凝膠電泳或者微流體、毛細(xì)管電泳等方法進(jìn)行RNA完整度的測(cè)定。對(duì)于濃度和純度，吸光度260/280和260/230的比值必須>1.8，濃度>100 ng/ul。對(duì)于RNA完整性的分析，如果用凝膠電泳分析，28S/18S比值必須>1.5；如果借助微流體、毛細(xì)管電泳儀分析， RIN值（Agilent bioanalyzer測(cè)定的RNA完整度）或RIS值（QIAGEN QIAxcel測(cè)定的RNA完整度）必須大于7。假如對(duì)您的RNA樣品質(zhì)量還有疑惑，請(qǐng)將這些質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)發(fā)送給QIAGEN技術(shù)人員，我們會(huì)幫您分析您的RNA樣品是否適合進(jìn)行PCR array。

cDNA合成：

我推薦以1 ug的總RNA為模板，用RT2 First Strand Kit (Cat # 330401)試劑盒進(jìn)行cDNA合成。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)這是最佳的起始反應(yīng)用量。假如RNA量不夠，起始總RNA樣品量最少可以減至400 ng，不過必須保證RNA的質(zhì)量足夠好；假如連400 ng的RNA樣品都無法保證，請(qǐng)聯(lián)系QIAGEN技術(shù)人員，您可能需要進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。請(qǐng)使用相同起始量的RNA進(jìn)行cDNA合成及后繼實(shí)驗(yàn)，以保證各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果間的可比性。

進(jìn)行PCR Array實(shí)驗(yàn)：

關(guān)鍵：加完樣后，將PCR板以1000 X g離心2-3分鐘。

請(qǐng)嚴(yán)格按照PCR array用戶手冊(cè)設(shè)置PCR程序。我們針對(duì)不同類型的熒光定量PCR儀，程序進(jìn)行了各自不同的優(yōu)化，所以不同類型儀器的程序請(qǐng)勿混用。此外，對(duì)于部分常見儀器我們已有現(xiàn)成的程序模板可供使用：http://sabiosciences.com/pcrarrayprotocolfiles.php

程序運(yùn)行結(jié)束后，基線可使用自動(dòng)設(shè)置，但閾值必須手動(dòng)設(shè)置。實(shí)驗(yàn)中所有需要數(shù)據(jù)相互比較的PCR array閾值必須設(shè)置成相同的數(shù)值，這樣數(shù)據(jù)間才有可比性。具體的閾值設(shè)置點(diǎn)可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整，我們推薦設(shè)置在擴(kuò)增曲線的下1/3處，使得PPC孔（標(biāo)準(zhǔn)96孔板式在H10-H12）的Ct值在17-19左右。

數(shù)據(jù)分析：

為了更好的了解我們的免費(fèi)在線數(shù)據(jù)分析工具，您可以先看一下我們的相關(guān)在線技術(shù)講座。講座列表：http://sabiosciences.com/seminarlist.php

數(shù)據(jù)分析前請(qǐng)確認(rèn)兩點(diǎn)：每個(gè)PCR array實(shí)驗(yàn)使用的初始RNA量是相同的；讀取Ct值時(shí)每個(gè)PCR Array的閾值設(shè)置都是相同的。然后您可以使用我們的在線免費(fèi)數(shù)據(jù)分析網(wǎng)頁：http://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php

您的數(shù)據(jù)必須使用老版本Excel格式（即文件擴(kuò)增名是.xls），我們的軟件才能識(shí)別。如果您用了一次檢測(cè)4個(gè)樣品的384孔板，請(qǐng)參見最后的注釋*。

正確選擇您的PCR Array貨號(hào)。如果您使用的是2012年5月以后的產(chǎn)品，產(chǎn)品貨號(hào)后面會(huì)有個(gè)“Z”，您在分析的時(shí)候也必須選擇帶有“Z”的貨號(hào)。貨號(hào)的形式是“PAXX‐###Z”。PCR array板的包裝紙醒目位置標(biāo)有您的PCR array貨號(hào)。“Z”字母后面的數(shù)字和字母與您的PCR儀器有關(guān)，不影響數(shù)據(jù)分析。

3個(gè)RTC孔Ct值之間的差值必須小于1；3個(gè)PPC孔也是如此。

基因組DNA污染檢測(cè)孔（GDC）的Ct值必須大于35，或者無檢測(cè)信號(hào)。假如小于35，請(qǐng)確認(rèn)柱上DNA消化步驟進(jìn)行得是否完全。

RTC與PPC孔Ct的差值必須小于5

分析軟件會(huì)自動(dòng)尋找最佳的看家基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)。我們會(huì)盡量選擇各組實(shí)驗(yàn)中Ct值相差在1以內(nèi)的作為看家基因。

*關(guān)于使用384孔板分析4個(gè)樣品的詳細(xì)注解：首先使用“96 Genes X 4 Samples”輔助工具，將4個(gè)樣品的數(shù)據(jù)分開。將384 Ct值粘貼到黃色列內(nèi)。如果使用的是預(yù)制的PCR Array，則不需要在紅色列內(nèi)填入數(shù)據(jù)，輸入貨號(hào)就會(huì)自動(dòng)填入基因名。將E10到H106的數(shù)據(jù)復(fù)制粘貼到B1到E97。之后您就可以按照前面所述的步驟進(jìn)行數(shù)據(jù)上傳和在線免費(fèi)分析了。