微生物學(xué)技術(shù):PCR法檢測支原體

PCR法是20世紀(jì)80年代中期建立起來的一種體外DNA擴增技術(shù)，其基本原理是酶促DNA合成反應(yīng)，即在DNA模板、引物和脫氧核糖核酸存在下，經(jīng)DNA聚合酶的作用，使DNA 鏈擴增延伸。該方法具有靈敏度高、特異性強、快速的特點，但其對實驗環(huán)境的要求嚴(yán)格，實驗成本較高，有時還有假陽性的現(xiàn)象出現(xiàn)。

1、儀器設(shè)備

超凈工作臺、PCR儀、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、臺式離心機、旋渦混懸器等。

2、實驗試劑

選用美國Stratagene公司生產(chǎn)的支原體檢測試劑盒（內(nèi)有引物、陽性對照、內(nèi)對照、StrataClean resin、緩沖液），dNTP，TapDNA聚合酶，緩沖液，瓊脂糖，礦物油。

3、實驗操作

PCR反應(yīng)的前期操作應(yīng)在無菌環(huán)境中進(jìn)行。

（1）樣品的收集：待測細(xì)胞用無雙抗培養(yǎng)基培養(yǎng)7d，用無菌容器取上清液500ul，4℃保存待測。

（2）模板的制作：在無菌的條件下，取細(xì)胞培養(yǎng)上清100ul于一無菌的0.5ml塑料離心管內(nèi)，蓋好蓋子，95℃水浴加熱5min。

（3）打開蓋子，向管內(nèi)加StrataClean resin10ul，蓋好蓋子，旋渦混懸器混合，離心5—10s，吸取上清至一新的塑料離心管中，模板制作完畢，4℃保存。

（4）PCR反應(yīng)：反應(yīng)體系最適條件為：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶�？偡磻�(yīng)體系為50ul，反應(yīng)用去離子水均需用12000uw/cm2紫外燈照射。反應(yīng)如下表：

 表 反應(yīng)程序

①在0.5ml塑料離心管中加入35.2ul去離子水及5ul*10Taq反應(yīng)緩沖液。

②依次加入下列成分：0.4uldNTPs（25mmol/l），0.4ulTaqDNA聚合酶（5U/ul），2ul引物。

③加2ul去離子水，總體積45ul。

④加2ul已制成的模板到反應(yīng)體系中。

⑤陽性對照，內(nèi)對照各5ul加入到各自的反應(yīng)體系中。

⑥取一支含有以上反應(yīng)體系的離心管，加入5ul去離子水作為陰性對照管。

⑦在反應(yīng)體系中加入100ul礦物油。

（5）瓊脂糖凝膠電泳：PCR反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠濃度2%。電泳結(jié)束后，凝膠成像分析結(jié)果。

（6）結(jié)果分析：該方法為檢測支原體的定性方法，在電泳泳道上，MARKER、陽性對照、內(nèi)對照均會出現(xiàn)不同的電泳條帶，當(dāng)被檢樣品泳道出現(xiàn)明亮條帶，且位置在陽性對照和陰性對照條帶位置之間，即可認(rèn)為該樣品被支原體污染。有時還會發(fā)現(xiàn)一條泳道出現(xiàn)多條，可能是該樣品感染兩種以上支原體所致。如果泳道內(nèi)條帶隱約出現(xiàn)，則可懷疑有支原體污染，重做該樣品。