D-熒光素鉀鹽/鈉鹽體外操作手冊--Goldbio

幾個因素將會影響反應(yīng)的靈敏度，包括溫度，pH或底物濃度。為得到最佳結(jié)果，在使用之前我們建議用pH7.8的緩沖液，并且所有試劑在室溫下預(yù)熱。為充分反應(yīng)，我們建議在分析緩沖液中加入過量的ATP和Mg²⁺。

在Gold Bio，我們建議用以Yuichi Oba, et al. (2003)為基礎(chǔ)的熒光素酶分析buffers：

-100mM Tris- HCl(pH7.8)

-5mM MgCl₂

-250 uM CoA

-150 uM ATP(Fraga, 2008)

-150 ug/ml d-Luciferin(啟維益成)

一些研究者在分析buffer中也加入其它成份，比如DTT或EDTA(Steghans, 1998)。根據(jù)您具體需要可以適當(dāng)調(diào)整分析buffer。為得到最佳結(jié)果，根據(jù)您具體細(xì)胞我們建議先做一個動力學(xué)曲線的初步測試。

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid potassium salt

KC₁₁H₇N₂O₃S₂

分子量：318.42 g/mol

4，5-Dihydro-2-(6-hydroxy-2-benzothiazolyl)-4-thiazolecarboxylic acid sodium salt

NaC₁₁H₇N₂O₃S₂.H₂O

分子量：320.32 g/mol

 

儲存：-20℃避光保存。

l  D-Luciferin salt for GoldBio Luciferin Stock Solution(GLSS)

   熒光素鉀鹽（啟維益成, G156410）

   熒光素鈉鹽（啟維益成,G156411）

l  GoldBio Luciferase Assay Buffer(TMCA)

Tris-HCl, pH7.8

MgCl₂

Coenzyme A(CoA)(hydrate)

ATP(disodium salt hydrate)

GLSS(GoldBio luciferin Stock Solution)

l  PBS(不含Ca²⁺或Mg²⁺)

l  細(xì)胞裂解buffer

l  熒光素酶（對照）

1.       用分子生物學(xué)級水配成15mg/ml（100×）熒光素儲備液

a.       為最佳結(jié)果，熒光素儲備液最好現(xiàn)配現(xiàn)用，但如果分成小份儲存在-80℃可最長保存一個月。

2.       在熒光素酶熒光分析中熒光素底物的終濃度應(yīng)該是：150ug/ml（471uM熒光素鉀鹽或468uM熒光素鈉鹽）

與TMCA混合之前用分子生物學(xué)級水制備所有試劑儲備液

1.       制備500mM MgCl₂（100×）溶液

a.       稱取476.05mg（95.21g/mol）的MgCl₂，溶于10ml水中。

b.       溶液儲存于室溫。

2.       制備25mM CoA(100×)溶液

a.       稱取191.88mg（767.53g/mol）輔酶A并溶于10ml水中。

b.       用5-10ml水先預(yù)濕0.2 um濾膜。

c.       通過預(yù)濕的濾膜濾滅100×輔酶A并存于-20℃。

3.       制備15mM ATP（100×）溶液

a.       稱取82.67mg（551.14g/mol）ATP并溶于10ml水中。

b.       存于-20℃。

4.       制備400mM Tris-HCl, pH7.8(4×)buffer

a.       稱取4.85g（121.14g/mol）Tris堿并溶于85ml水中。

b.       用1M的HCl調(diào)pH到7.8然后定容到100ml。

5.       室溫下制備新鮮的2×TMCA工作液

a.       計算出實驗所需要的TMCA，然后用水混合所有的成份到2×工作濃度（在熒光素酶分析buffer中隨后稀釋到1×）

比如：1ml TMCA(2×):

500ul Tris-HCl（4×儲備液）

20ul MgCl₂（100×儲備液）

20ul CoA（100×儲備液）

20ul ATP(100×儲備液)

用水定容至1ml。

b.       如果必要可同時另加其它成份（比如DTT, EDTA）。

為滿足客戶需求Goldbio最近提供一系列裂解buffers。下面的buffers如果您有什么問題請聯(lián)系我們獲取更多的信息。

l  細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer（啟維益成，G176415/G156285）

l  哺乳動物細(xì)胞裂解buffer（啟維益成，G176416）

l  組織培養(yǎng)裂解buffer（啟維益成，G156287）

l  酵母裂解buffer（啟維益成，G156286/ G176417）

對于細(xì)胞培養(yǎng)有兩個基本體系，一個是單層培養(yǎng)（貼壁的），一個是懸浮培養(yǎng)（非貼壁的）。大部分動物來源的細(xì)胞都是貼壁依賴型（造血干細(xì)胞或相似細(xì)胞系除外）并且需要有一個適合的能夠輕易地使細(xì)胞附著的培養(yǎng)器皿（經(jīng)常被稱為細(xì)胞培養(yǎng)改性處理）。但也有很多細(xì)胞系用懸浮培養(yǎng)的方法。懸浮培養(yǎng)不需要經(jīng)過改性處理，但是培養(yǎng)基必須被攪拌來獲得充足的氣體交換從而避免細(xì)胞死亡。每天監(jiān)測懸浮細(xì)胞數(shù)量來確定細(xì)胞生長情況和密度。稀釋懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物來刺激細(xì)胞生長。

   對于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，每天用倒置顯微鏡監(jiān)測以確定細(xì)胞覆蓋。大部分貼壁細(xì)胞達(dá)到80-90%的細(xì)胞覆蓋應(yīng)繼代培養(yǎng)一次以避免營養(yǎng)消耗和細(xì)胞死亡。貼壁細(xì)胞總是需要組織培養(yǎng)器皿改性處理來獲得適當(dāng)?shù)母街�和生長。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)目的也可以用玻璃器皿代替一次性塑料培養(yǎng)板，但是保證所有的去污劑殘留被清除是必須的，并且使用之前應(yīng)該被滅菌。不同的細(xì)胞系貼壁程度是不同的，但大部分情況下，用胰蛋白酶（或其它的蛋白酶）來釋放細(xì)胞。有些細(xì)胞系可能不適合用蛋白酶（比如當(dāng)?shù)鞍酌笇��?xì)胞是有害的或當(dāng)它們是感興趣的膜標(biāo)志物或受體）。為了易于從培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上分離細(xì)胞，細(xì)胞刮應(yīng)帶一部分體積的懸浮培養(yǎng)基帶進(jìn)細(xì)胞。

（依據(jù)-分子生物學(xué)，vol. 290: 基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)手冊）

1.       從已經(jīng)達(dá)到理想的細(xì)胞覆蓋的培養(yǎng)皿中吸出培養(yǎng)基，用2-3ml RT PBS（不含Ca²⁺或Mg²⁺）洗單層細(xì)胞以洗去所有生長培養(yǎng)基殘留物。

2.       吸出PBS然后加入3-4ml RT 胰蛋白酶-EDTA(T/E)。37℃孵育3-5分鐘。用倒置相差顯微鏡監(jiān)測培養(yǎng)物生長進(jìn)展。

3.       細(xì)胞一旦分離下來，轉(zhuǎn)移含6-7ml培養(yǎng)基（包含足夠的血清抑制胰蛋白酶活性）的細(xì)胞到離心管中進(jìn)行離心。為了從培養(yǎng)皿中獲得所有細(xì)胞，用5ml的細(xì)胞/培養(yǎng)基混合物沖洗培養(yǎng)皿一到兩次然后把懸浮細(xì)胞液加入初始的用胰蛋白酶處理的細(xì)胞中。

4.       用血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)并繼續(xù)裂解步驟。

Note：細(xì)胞裂解之前應(yīng)該被離心并沖洗（參看下面）

使用之前配制：根據(jù)應(yīng)用，可能加入DTT和EDTA。制備適量的細(xì)胞裂解buffer（哺乳動物或酵母）加入DTT和EDTA使終濃度為5mM。如果體系中的二價金屬離子是反應(yīng)必要的，則不加EDTA，而是用合適的二價鹽使終濃度成為5mM。

蛋白酶抑制劑—在提取過程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制劑來抑止蛋白酶活性（參看ProBlock^TM Gold 哺乳動物蛋白酶抑制劑，啟維益成，G156290，或ProBlock^TM Gold 酵母/真菌蛋白酶抑制劑，啟維益成，G156292）。

1.       細(xì)胞在200-500×g條件下離心5分鐘，移取并棄上清液。對于貼壁細(xì)胞，從培養(yǎng)板上刮或分離細(xì)胞（參看上面：“分離貼壁細(xì)胞”），離心并棄上清。

2.       用5-10ml PBS（不含Ca²⁺或Mg²⁺）洗細(xì)胞，然后移去上清，輕輕拍打離心管壁讓細(xì)胞變得松弛，再用5-10ml PBS來回吸吐進(jìn)行重懸。再次離心。

3.       移取并棄去PBS洗液。

4.       在剩余的PBS洗液中輕輕吸吐重懸細(xì)胞。加入哺乳動物裂解buffer懸起細(xì)胞。每10ml生長良好的懸浮培養(yǎng)物，加大約1ml哺乳動物裂解buffer。

或者：每0.05g濕的細(xì)胞加1 ml哺乳動物裂解buffer。獲得濃縮的細(xì)胞提取物，減少哺乳動物細(xì)胞裂解buffer。這種情況下，凍融一次可確保細(xì)胞完全裂解。

5.       用移液槍頭混勻細(xì)胞直到成為勻一的懸浮液為止。在冰上孵育15-30min。不時地翻轉(zhuǎn)混勻懸浮液以便裂解充分。

注意：凍融步驟并不是裂解所必須的。一次或兩次凍融對細(xì)胞是沒有傷害的，但可以確保細(xì)胞完全裂解。

6.       在冷凍離心機(jī)里20,000×g離心懸浮液30分鐘，收集上清液并分析。

注意：細(xì)胞殘留物中可能含有核膜結(jié)合蛋白，這可能需要不同的去去污劑來進(jìn)一步提取。

1.       200-500×g離心酵母細(xì)胞（OD₆₀₀1.5-2.0）5-10分鐘，在等體積的酵母懸浮buffer中懸浮細(xì)胞。每100ul酵母懸浮細(xì)胞加1ul β-巰基乙醇。

2.       輕輕地吸吐細(xì)胞懸浮液直到成勻一狀。在4℃下孵育5分鐘。再輕輕地吸出懸浮細(xì)胞。

3.       加入Zymolyase^R (裂解酶)輕彈以混勻溶液。每100ul細(xì)胞懸浮液加入10ul裂解酶，輕輕地混勻。

4.       37℃孵育30-60分鐘，取25ul懸浮液與1ml酵母裂解buffer混勻，然后讀取OD₈₀₀的吸光度值。

5.       孵育結(jié)束，1,500×g離心5分鐘，小心棄上清，留原生質(zhì)球在離心管中。

可選擇：加5-10ul酵母懸浮buffer到原生質(zhì)球中，輕拍離心管重懸菌體。按照上面的步驟離心然后棄上清。

6.       裂解：在適當(dāng)體積的酵母裂解buffer（菌體體積的2-3倍）中懸浮酵母菌體。輕輕吸吐菌體來回幾次。冰上孵育30分鐘并不時地翻轉(zhuǎn)。在37℃下孵育1-3分鐘或短暫超聲步驟可能更有助于裂解。對于剪切基因組DNA來說超聲是必要的。請注意：對酵母菌體得率，越多的酵母裂解buffer，細(xì)胞裂解的越好。

7.       20,000×g 4℃離心30分鐘，收集裂解物，下游分析備用。

注意：額外的酵母裂解buffer可另購作下游分析用。比如色譜分析或透析等。

l  Zymolyase^R是Kirin Brewery Co. Ltd.的注冊商標(biāo)。

使用前制備：根據(jù)應(yīng)用，可能加入DTT和EDTA。制備適量的細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer加入DTT和EDTA使終濃度為5mM。如果體系中的二價金屬離子是反應(yīng)必要的，則不加EDTA，而是用合適的二價鹽使終濃度成為5mM。

蛋白酶抑制劑-在提取過程中如果蛋白酶的活性需要被抑制，可加入蛋白酶抑制劑來抑止蛋白酶活性（參看ProBlock^TM Gold 細(xì)菌蛋白酶抑制劑，啟維益成 ，G156289）。

1.       把培養(yǎng)好的OD₆₀₀為1.5-3.0的細(xì)菌細(xì)胞以200-500×g條件下離心10分鐘，用5-10ml的細(xì)菌裂解buffer懸浮細(xì)胞（比如25ul的細(xì)胞菌體用125-250 ul細(xì)菌裂解buffer）。

2.       輕輕吸吐懸浮細(xì)胞直到成均一狀。在冰上或4℃孵育5分鐘。再輕輕吸出然后懸浮。

3.       旋渦振蕩包含裂解酶的冰凍懸浮液離心管。在細(xì)菌裂解buffer中第100ul細(xì)胞懸浮液加5ul裂解酶，輕輕混勻。

4.       在37℃孵育懸浮細(xì)胞30-60分鐘。

可選擇—取25ul懸浮液并與1ml細(xì)菌細(xì)胞裂解buffer混勻并讀取OD₅₉₀吸光度值來監(jiān)測細(xì)胞裂解程度。

5.       孵育期間，翻轉(zhuǎn)離心管來回幾次助于細(xì)胞充分裂解。用一個小量程移液槍來回吸吐懸浮液或用一個20-gauge的注射器針頭將更有助于細(xì)胞裂解。

注意—額外體積的細(xì)菌裂解buffer用作下游分析可另購比如色譜分析或透析等。

6.       去除DNA--裂解期間，細(xì)胞DNA和RNA應(yīng)被分開這樣可降低裂解物的粘性。一些DNA碎片可能存在但不會干擾下游過程。然而，為完全去除核酸，在細(xì)菌裂解buffer中不要加入EDTA，完全裂解后，再加入EDTA使終濃度成為2.5mM。

7.       4℃以20,000條件下離心裂解物30分鐘，并收集裂解物以備下游分析。

溶菌酶污染是不可接受的。用以上細(xì)菌蛋白提取方法步驟1-4，然后：

5.       孵育之后，200-500×g條件下離心10分鐘。小心移棄上清液，留原生質(zhì)球于離心管中。

可選擇—在5-10ml細(xì)菌懸浮buffer中重懸原生質(zhì)球。按照上面的步驟再次離心并棄上清。

6.       裂解：在適當(dāng)體積的細(xì)菌裂解buffer（2-3倍體積的原生質(zhì)球）中重懸原生質(zhì)球。重復(fù)吸吐懸浮液幾次。冰上孵育30分鐘并不時地翻轉(zhuǎn)。在37℃孵育細(xì)胞1-3分鐘或短暫超聲更有助于細(xì)胞裂解。請注意，就原生質(zhì)球得率而言，細(xì)菌裂解buffer越多，細(xì)胞裂解的越充分。

7.       4℃ 20,000×g離心裂解物30分鐘并收集裂解物以備下游分析。

包涵體的分離：對于分離包涵體，裂解步驟之后，4℃ 30,000×g離心細(xì)菌裂解物30分鐘，收集包涵體并用10倍液的細(xì)胞裂解buffer洗兩次（在buffer中懸浮并離心收集包涵體）。收集包涵體溶解并濃縮。

為計算樣品中熒光素酶的絕對含量（如果需要的話），根據(jù)您的光度計做光檢測的線性范圍是非常必要的。光度計在高光密度下會信號飽和。為光度計做線性范圍：

1.       在1×裂解buffer（或在純化熒光素酶的PBS buffer中）中設(shè)置一系列稀釋的熒光素酶含1mg/ml的BSA（可以用細(xì)胞培養(yǎng)裂解物或純的熒光素酶）（BSA有助于熒光素酶的穩(wěn)定性）。

a.       為檢測背景熒光也可包括不含熒光素酶的樣品(作為陰性對照)

純化的熒光素酶儲存液：在100mM Tris-HCl pH7.8/ 5mM MgCl2中溶解1mg熒光素酶，分成等份兒冰凍于-20℃或與100%甘油混合然后儲存于-20℃（甘油儲存將不會結(jié)冰）。冰凍的熒光素酶儲存液和熒光素酶甘油儲存液在-20℃至少保存兩年仍有活性。

2.       加100ul 2×TMCA（1×終濃度）到比色皿中或96孔板中。

3.       每個樣品中加2ul 100×GLSS（1×終濃度）

4.       加98ul稀釋的熒光素酶儲存液或裂解物到比色杯中或板子中。避光（這樣利于熒光穩(wěn)定對于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線更準(zhǔn)確）室溫下孵育5-10分鐘。

a.       為取得最佳結(jié)果，讀數(shù)之前每個樣品的孵育時間應(yīng)該一致。

b.       注：這個體積是按照加入100×GLSS，終濃度為1×TMCA來計算的，不同的總體積，要相應(yīng)地重新計算反應(yīng)混合液。

5.       用光度計記錄光密度值。

6.       產(chǎn)生熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出光產(chǎn)量vs. 細(xì)胞數(shù)量（或vs.ug 熒光素酶）。

注：如果按照上述步驟沒有產(chǎn)生一個合適的線性輪廓圖，您可以調(diào)整熒光素的濃度（通常降的更低）

熒光素酶熒光分析很大程度上依賴于光度計（是否是手動的，單通道注射或整板讀的光度計）。關(guān)于您具體的光度計跟它的注射容量和編程指令有關(guān)（注：GLSS濃度根據(jù)不同光度計的注射體積不同需要做適當(dāng)?shù)恼{(diào)整）。

分析反應(yīng)混合液時，TMCA的終濃度應(yīng)該是1×。GLSS和裂解物的體積應(yīng)根據(jù)最終TMCA體積來調(diào)整。

例1：手動光度計（200ul 終反應(yīng)體積）

1.       吸取100ul TMCA到一個干凈的比色杯中。

2.       吸取50-98ul 裂解物到比色杯中。

3.       如果必要用水把體積定容至198ul。

4.       吸取2ul GLSS（1×終濃度）并在光度計上立即讀取數(shù)據(jù)。

例2：注射光度計（單一樣品或整板）（200ul終反應(yīng)體積）

1.       吸取100ul TMCA到光度計比色杯中或96孔板的每孔中（白色固體的，平底板最好）。

2.       吸取50-98ul 裂解物到比色杯或孔中。

3.       如果必要用水把體積定容至198ul。

4.       需要2-5秒鐘用程序指令光度計注射GLSS后在隨后的10秒鐘檢測。