如何選擇熒光定量檢測法之SYBR Green I

總的說來，熒光檢測技術(shù)可大致分為兩大類：通用型的熒光染料檢測法和高特異性的熒光探針法。前者主要是利用熒光染料(如SYBR Green I)與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增加，優(yōu)點是：無需另外設(shè)計熒光探針，無需特別優(yōu)化條件，簡便易行，成本較低，能適用于任何一款定量PCR儀，缺點是專一性不如探針法；而后者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來識別模版，優(yōu)點是特異性更高，適用于擴增序列專一檢測(見下表)，不過增加了熒光探針的成本。

除了以上這些，還有雙探針系統(tǒng)(bi-probe system)、BODIPY FL標(biāo)記探針、Light- up探針、iFRET(induced fluorescence resonance energy transfer) 技術(shù)、Qzyme 探針和Magiprobe等等。

這么多種熒光標(biāo)記方法，在選擇的時候當(dāng)然要根據(jù)各人實驗設(shè)備、實驗?zāi)康囊约皩嶒炓�求，還有經(jīng)費來判斷了。

對于專一性要求不高的實驗，或者是大規(guī)模高通量的實驗，使用方便、花費較小的熒光染料可以作為你初步的選擇對象。老實說，熒光染料法實質(zhì)上無非就是常規(guī)的PCR反應(yīng)中添加了熒光染料，借助染料和雙鏈DNA的結(jié)合所發(fā)出的熒光實時監(jiān)控反應(yīng)的進程。由于不需要設(shè)計序列特異性探針和優(yōu)化反應(yīng)條件，價格低廉，通用性強，而且熒光染料法可用于任何一種型號的定量PCR儀，因而同樣得到廣泛采用。熒光染料法的專一性和PCR沒有本質(zhì)的區(qū)別---但是作為“失之毫厘，謬之千里”高度精確的實驗，你依然可以選擇更好的熒光染料、更嚴(yán)謹(jǐn)專一的PCR酶、更好的緩沖體系來提高反應(yīng)的可靠程度。

在熒光染料法的定量PCR反應(yīng)試劑中，最常用的是SYBR Green I，這種高靈敏度，較低毒性的核酸染料最大激發(fā)波長497nm，最大發(fā)射波長是520nm，在結(jié)合雙鏈DNA分子后熒光增強800-1000倍，靈敏度較EB更高，毒性較EB低，可避免EB對于小分子量DNA靈敏度較低，而在監(jiān)測大分子量DNA區(qū)域可能會出現(xiàn)背景色等等弱點，因此經(jīng)過時間的篩選漸漸成為了定量PCR熒光染料的“當(dāng)家花旦”。

在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR Green I熒光染料，SYBR熒光染料摻入DNA雙鏈后熒光信號顯著增強；當(dāng)DNA變性時SYBR Green I染料釋放出來，熒光急劇減少；隨后在聚合延伸過程中引物退火并形成PCR產(chǎn)物，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，經(jīng)檢測獲得熒光的凈增量。熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

熒光染料可以在反應(yīng)末尾對擴增產(chǎn)物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，定量PCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值�；�于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈就可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應(yīng)中擴增到的產(chǎn)物，因此用溶解曲線數(shù)據(jù)就可以進行定量監(jiān)督了。

安全性：SYBR染料的致突變性遠(yuǎn)低于EB數(shù)倍甚至數(shù)十倍(取決于不同受檢物種或株系)

超高靈敏度：具有1000倍以上的熒光增強效果和0.6的量子產(chǎn)量；與此相比，EB只有大約30倍的熒光增強效果和0.15的量子產(chǎn)量。因此，SYBR Gold檢測核酸的靈敏度是EB的十倍以上。(這主要是因為SYBRGreen是和DNA小溝結(jié)合，而EB則是嵌入到堿基之間)

使用電泳后染色程序可提高靈敏度，而滲透入凝膠的速度極快。

通用性：可在各種類型的凝膠如高濃度瓊脂糖、乙二醛瓊脂糖、甲酰胺瓊脂糖、聚丙烯酰胺和尿素-聚丙烯酰胺凝膠中檢測雙鏈DNA。

簡便易用：只須將凝膠在染色液中保溫10-40分鐘(取決于凝膠的厚度和濃度)，無須脫色，背景極低。

與其他分子生物學(xué)技術(shù)兼容：對酶切、連接和PCR反應(yīng)都沒有影響。

與常規(guī)儀器兼容：可用300-495nm的任何類型的光源激發(fā)。

適合高通量大規(guī)模的定量PCR檢測。

SYBR Green I 的使用濃度是影響實驗成功與否的關(guān)鍵因素，如果SYBR Green I的濃度不飽和會使熒光信號不能反應(yīng)產(chǎn)物量的變化。而過高濃度則會抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)效率。通常試劑盒會有比較現(xiàn)成的方案。提高鎂離子濃度可以降低SYBR Green I對PCR反應(yīng)的抑制作用。在用SYBR Green I進行熒光PCR反應(yīng)時， 鎂離子濃度要比無SYBR Green I 的普通 PCR 反應(yīng)要高(0.5-2mM)。

然而雖然SYBR Green熒光染料可以用來監(jiān)測各種雙鏈DNA序列的擴增，靈活性高是它的優(yōu)點，但是正如一個硬幣有兩面，通用性高就意味著專一性低，由于熒光染料可以和任何雙鏈DNA結(jié)合，因此DNA引物二聚體(primer-dimers)或其它非特異擴增產(chǎn)物(spurious PCR)可以對定量結(jié)果產(chǎn)生干擾(導(dǎo)致低Ct值)，同時也降低了反應(yīng)的專一性和可重復(fù)性---而這一點對于定量PCR分析十分重要。

舍不得SYBR Green I的方便、通用、便宜的優(yōu)點，又希望提高其專一性，許多人做了不少嘗試：比如仔細(xì)的設(shè)計引物和純化模板、比如使用能分析產(chǎn)物熔解曲線的軟件可以解決引物二聚體的問題選擇，還有就是采用嚴(yán)格熱啟動的擴增酶減少非特異擴增、采用特定的緩沖系統(tǒng)減少引物二聚體和錯配形成、采用修飾堿基減少二級結(jié)構(gòu)或者改變穩(wěn)定性、在Tm值以上進行熒光測定減少引物二聚體的影響等等。提高PCR的特異性已經(jīng)是老大難問題了，對于貪圖方便、便宜的實驗新手來說不一定能考慮周全，這也就是為什么許多希望能通過在普通PCR基礎(chǔ)上摸索條件，自己完成定量PCR檢測的研究人員發(fā)現(xiàn)結(jié)果不理想的主要原因之一。因此，不少生物技術(shù)公司針對熒光染料特異性缺點使出了各家的法寶，提出了有建設(shè)性和有新意的解決方案也讓這個熒光檢測技術(shù)繼續(xù)煥發(fā)光彩。