RNA酶污染的預(yù)防措施

RNA的的化學(xué)性質(zhì)比DNA活躍得多。RNA分子上緊鄰磷酸二脂鍵的2′羥基基團(tuán)能直接被RNA酶利用來(lái)作為活性因子，從而使得RNases無(wú)需金屬離子就能發(fā)揮活性。由于RNA酶在環(huán)境中廣泛存在，特別是RNase A，結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，不能通過(guò)高溫高壓滅菌失活，因而極難消除，對(duì)保持RNA樣品的完整性構(gòu)成極大的威脅。由于RNase A類酶依賴于活性位點(diǎn)處的組氨酸殘基起催化作用，因此能被組氨酸烷化劑DEPC所抑制。為了避免RNA降解，RNA相關(guān)實(shí)驗(yàn)都嚴(yán)格應(yīng)遵循下述操作規(guī)則：

 

1.使用RNase-free溶液；

 

2.佩戴清潔一次性手套并經(jīng)常更換；

 

3.建立RNA工作專區(qū)，使用專用的移液器和RNase-free槍頭；

 

4.使用無(wú)菌的一次性塑料器皿，盡量避免使用玻璃器皿；

 

5.金屬工具可以用快速灼燒數(shù)秒鐘的方式來(lái)快速消除污染；

 

6.玻璃器皿可在180℃以上溫度下烘焙數(shù)小時(shí)，或用新鮮配制的0.1%(v/v) DEPC或無(wú)水乙醇浸泡一小時(shí)后，高壓滅菌去除殘余的DEPC；

 

7.電泳槽等含聚碳酸脂或聚苯乙烯材料的器皿應(yīng)該在3%的過(guò)氧化氫中浸泡10分鐘，然后用大量的RNase-free水沖洗干凈后使用；

 

8.塑料制品可用新鮮配制的0.1% (v/v) 的DEPC水浸泡過(guò)夜，然后高溫高壓滅菌1小時(shí)水解殘留的DEPC；

 

9.試劑處理：

1）每升溶液中加入1 ml的DEPC，室溫振蕩過(guò)夜或37℃振蕩1小時(shí)后，高溫高壓滅菌1小時(shí)水解殘留的DEPC；

2）由于DEPC可以和初級(jí)氨基基團(tuán)起反應(yīng)，故含Tris的溶液不宜用DEPC處理。應(yīng)使用新開(kāi)瓶（RNA專用）的Tris粉末，溶于DEPC處理水或Milli-Q水中，適用RNA專用電極調(diào)整pH值后，高溫高壓滅菌；

3）對(duì)于遇熱不穩(wěn)定的化合物(如DTT、核苷、錳鹽等)，應(yīng)直接將其(最高純度)溶于DEPC處理水或Milli-Q水中，使用0.2 μm的濾膜過(guò)濾滅菌；

4）無(wú)水乙醇、異丙醇等試劑開(kāi)瓶后作RNA專用；75%乙醇應(yīng)使用無(wú)水乙醇與DEPC處理水配制；

5）反應(yīng)體系中添加RNA酶抑制劑。