ELISA技術(shù)綜述

ELISA利用抗原抗體之間專(zhuān)一性結(jié)合之特性，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)；由于結(jié)合與固體承載物（一般為塑膠孔盤(pán)）上之抗原或抗體仍可具有免疫活性，因此設(shè)計(jì) 其結(jié)合 機(jī)制後，配合酵素顯色反應(yīng)，即可顯示特定抗原或抗體是否存在，并可利用顯色之深淺進(jìn)行定量分析。根據(jù)待測(cè)樣品與結(jié)合機(jī)制的不同，ELISA可設(shè)計(jì)出各種不 同類(lèi)型的檢測(cè)方式，主要以"三明治法"(sandwich)、"間接法"(indirect)、以及"競(jìng)爭(zhēng)法"(Competitive)三種為主，以下 為各種方法之介紹。

 

見(jiàn)ELISA的雙抗夾心法原理；

ELISA的雙抗夾心法，又稱"三明治法"。

三明治法常用于檢測(cè)大分子抗原，一般之操作步驟為：

將具有專(zhuān)一性之抗體固著(coating)于塑料孔盤(pán)上，完成後洗去多馀抗體；
加入待測(cè)標(biāo)本，標(biāo)本中若含有待測(cè)之抗原，則其會(huì)與塑料孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合；
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本，加入標(biāo)記有酵素之二次抗體，與抗原結(jié)合；
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體，加入酵素受體使呈色，以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

三明治法分別以兩種抗體對(duì)標(biāo)本中的抗原進(jìn)行兩次專(zhuān)一性辨認(rèn)，因此專(zhuān)一性相當(dāng)高，但此待測(cè)抗原必須是多價(jià)抗原，如此才可獲得兩種以上的專(zhuān)一性抗體，以分別進(jìn)行夾心；而且此法需要足夠的表位空間以進(jìn)行抗原抗體的夾心，所以并不適用于半抗原或小分子抗原等分子量較小之標(biāo)的。

 

ELISA雙抗夾心法的衍生方法如ABC法：ELISA的生物素 -親和素系統(tǒng)，該產(chǎn)品系列是檢測(cè)方法上的重要革命。生物素/親和素系統(tǒng)用于ELISA一般有三種形式，即橋聯(lián)法（BAB）、標(biāo)記法 （BA）和ABC法，不少學(xué)者用之檢測(cè)了不同的抗原—抗體系統(tǒng)均取得了較好的結(jié)果，其中以BA法和ABC法應(yīng)用較多，敏感性一般比常規(guī)ELISA法高 4～80倍。

所謂ABC技術(shù)是指Avidin : Biotinylated Enzyme Complex Technology，親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物技術(shù)，所謂的ABC系統(tǒng)，被普遍視為目前最靈敏、最可靠與最有效的染色系統(tǒng)，并被廣泛應(yīng)用于免疫 組織化學(xué)、免疫電鏡、原位雜交與凝集素化學(xué)中。而該系統(tǒng)仍在不斷地發(fā)展，以滿足廣大研究人員的各種不同要求（如多抗原的標(biāo)記檢測(cè)）。

 

ELISA的間接法：

 

間接法常用于檢測(cè)抗體，一般之操作步驟為：
將已知之抗原固著于塑膠孔盤(pán)上，完成後洗去多馀之抗原；
加入待測(cè)標(biāo)本，標(biāo)本中若含有待測(cè)之一次抗體，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗原進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合；
洗去多馀待測(cè)標(biāo)本，加入帶有酵素之二次抗體，與待測(cè)之一次抗體結(jié)合；
洗去多馀未結(jié)合的二次抗體，加入酵素受體使酵素顯色，以肉眼或儀器讀取顯色結(jié)果。

 

ELISA的競(jìng)爭(zhēng)法原理；

 

競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制，一般用于檢測(cè)小分子抗原，其操作步驟為：
將具有專(zhuān)一性之抗體固著于塑膠孔盤(pán)上，完成後洗去多馀抗體；
加入待測(cè)標(biāo)本，使標(biāo)本中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合；
加入帶有酵素之抗原，此抗原也可與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專(zhuān)一性結(jié)合，由于塑膠孔盤(pán)上固著的抗體數(shù)量有限，因此當(dāng)標(biāo)本中抗原的量越多，則帶有酵素之抗原可結(jié)合的固著抗體就越少，亦即，兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤(pán)上抗體結(jié)合，即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
洗去標(biāo)本與帶有酵素之抗原，加入酵素受體使酵素顯色，當(dāng)標(biāo)本中抗原量越多，代表塑膠孔盤(pán)內(nèi)留下的帶有酵素的抗原越少，顏色也就越淺。
當(dāng)需要檢測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著在塑膠孔盤(pán)上時(shí)，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA。

 

在臨床檢驗(yàn)或者科研檢測(cè)中，ELISA 實(shí)驗(yàn)通常有商品試劑盒提供。ELISA試劑盒中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物等。

完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；
（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（3）酶的底物；
（4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；
（5）酶聯(lián)物（結(jié)合物）及標(biāo)本的稀釋液；
（6）洗滌液；
（7）酶反應(yīng)終止液。

 

已包被抗原或抗體的固相載體在低溫（2~8℃）干燥的條件下一般可保存6個(gè)月以上。有些不完整的試盒，僅供應(yīng)包被用抗原或抗體，檢測(cè)人員需自行包被。如BioTNT 網(wǎng)站中，代理的產(chǎn)品，有的是complete的試劑盒，有的是需要再進(jìn)行包被的duoset，或者是其他的說(shuō)法，都是不完整的試劑盒。

 

1.1 固相載體

固相載體在ELISA測(cè)定過(guò)程中作為吸附劑和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)�？勺鱁LISA中載體的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性，加之它的價(jià)格低廉，所以被普遍采用。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。

ELISA載體的形狀主要有三種：微量滴定板、小珠和小試管。以微量滴定板最為常用，專(zhuān)用于EILSA的產(chǎn)品稱為ELISA板，國(guó)際上標(biāo) 準(zhǔn)的微量滴定板為8×12的96孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測(cè)，有制成8聯(lián)孔條或12聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn)ELISA板相同。ELISA板的 特點(diǎn)是可以同時(shí)進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測(cè)，并可在特制的比色計(jì)上迅速讀出結(jié)果�，F(xiàn)在已有多種自動(dòng)化儀器用于微量滴定板型的ELISA檢測(cè)，包括加樣、洗滌、保 溫、比色等步驟，對(duì)操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性能特別是對(duì)免疫球蛋白的吸附性能增加，應(yīng)用于雙抗體夾心法可使固相上抗體量增 多，但用于間接法測(cè)抗體時(shí)空白值較大。

 

良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔 之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大，因此，每一批號(hào)的ELISA板在使用前須事先檢查其性能。 常用的檢查方法為：以一定濃度的人IgG（一般為10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗滌后每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋度的酶標(biāo)抗人IgG抗體，保溫后洗滌， 加底物顯色，終止酶反應(yīng)后，分別測(cè)每孔溶液的吸光度�？刂品磻�(yīng)條件，使各孔讀數(shù)在吸光度0.8左右。計(jì)算全部讀數(shù)的平均值。所有單個(gè)讀數(shù)與全部讀數(shù)的均數(shù) 之差，應(yīng)小于10%。

 

與聚苯乙烯類(lèi)似的塑料是聚氯乙烯。作為ELISA固相載體，聚氯乙烯的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可剪割，價(jià)廉，但光潔度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

 

為比較不同固相在某一ELISA測(cè)定中的優(yōu)劣，可應(yīng)用如下的試驗(yàn)：用其他免疫學(xué)測(cè)定方法選出一個(gè)典型的陽(yáng)性標(biāo)本和陰性標(biāo)本，將它們進(jìn)行一系列稀釋后，在 不同的固相載體上按預(yù)定的ELISA操作步驟進(jìn)行測(cè)定，然后比較結(jié)果。在哪一種載體上陽(yáng)性結(jié)果與陰性結(jié)果差別最大，這種載體就是這一ELISA測(cè)定項(xiàng)目的 最合適的固相載體。

在ELISA中，用作固相載體的小珠一般為直徑0.6cm的圓珠，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大大增加。ELISA板孔的吸 附面積約為200mm2，小珠均為1000mm2，將近ELISA板孔的5倍。吸附面積的增大即意味著固相抗原或抗體量的增加。再者，球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原決定簇或抗體結(jié)合位點(diǎn)的暴露面處于最佳反應(yīng)狀態(tài)，因此珠式ELISA的反應(yīng)往往更為靈敏。小珠的另一特點(diǎn)是更易于使洗滌徹底，使用特殊 的洗滌器，使小珠在洗滌過(guò)程中滾動(dòng)淋洗，其洗滌效果遠(yuǎn)較板孔的浸泡式為好。但由于磨砂工藝的難度較大，小珠的均一性較差。

 

小試管作為固相載體也有較大的吸附表面，而且標(biāo)本的反應(yīng)量也相應(yīng)增加。板式及珠式ELISA的標(biāo)本量一般為00-200ul，而小試管可根據(jù)需要加大反應(yīng)體積，標(biāo)本反應(yīng)量的增加有助于試驗(yàn)敏感性的提高。小試管還可以當(dāng)作比色杯，最后直接放入分光光度計(jì)中比色。

 

也有應(yīng)用聚苯乙烯膠乳或其他材料制成的微粒作為ELISA固相載體的。其優(yōu)點(diǎn)是表面積極大，反應(yīng)在懸液中進(jìn)行，其速率與液相反應(yīng)近似。以含鐵的磁性微粒作為ELISA固相載體，反應(yīng)后用磁鐵的吸引進(jìn)行分離，洗滌方便，試劑盒一般均配以特殊儀器。

 

應(yīng)用于科研領(lǐng)域，定量檢測(cè)的試劑盒，對(duì)固相載體的要求比較高，一般采用nunc 或者costar，或者其他知名品牌的酶標(biāo)板，來(lái)進(jìn)行包被。

 

以下簡(jiǎn)述固相載體和包被過(guò)程。

將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被(coating)。換言之，包被即是抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過(guò)程。蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合 的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用力。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。載體對(duì) 不同蛋白質(zhì)的吸附能力是不相同的，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。IgG對(duì)聚苯乙烯等固相具有較強(qiáng)的吸附 力，其聯(lián)結(jié)多發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外，因此抗體的包被一般均采用直接吸附法。蛋白質(zhì)抗原大多也可采用與抗體相似的方法包被。當(dāng)抗原決定簇存在 于或鄰近于疏水區(qū)域時(shí)，抗原與固相載體的直接吸附可使抗原決定簇不能充分暴露，在這種情況下，直接包被效果不佳，可以采用間接的捕獲包被法，即先將針對(duì)該 抗原的特異抗體作預(yù)包被，其后通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使抗原固相化。此間接結(jié)合在固相上的抗原遠(yuǎn)離載體表面，其抗原決定簇也得以充分暴露。間接包被的抗原經(jīng)固相 抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法，試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。間接 包被的另一優(yōu)點(diǎn)是抗原用量少，僅為直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯載體上的非蛋白質(zhì)抗原可采用特殊的包被方式。例如，在檢測(cè)抗 DNA抗體時(shí)，需用DNA作為包被抗原，而普遍的固相載體一般不能直接與核酸結(jié)合。可將聚苯乙烯板先經(jīng)紫外線照射（例如30W紫外燈，75cm照射12小 時(shí)），以增加其吸附性能。固相載體先用堿性蛋白質(zhì)，如聚賴氨酸、魚(yú)精蛋白等作預(yù)包被，也可提高核酸的結(jié)合力。也可用親和素生物素系統(tǒng)作間接包被，即用親和素先包被載體，然后加入生物素化的DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。

脂類(lèi)物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。抗心磷脂抗體的ELISA試劑一般采用這種包被方式。

 

用于包被固相載體的抗原按其來(lái)源不同可分為天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類(lèi)。天然抗原可取自動(dòng)物組織、微生物 培養(yǎng)物等，須經(jīng)提取純化才能作包被用。如HBsAg可以從攜帶者的血清中提取，一般的細(xì)菌和病毒抗原可以從其培養(yǎng)物中提取，蛋白成份抗原可從富含此抗原的 材料中提取等（例如AFP從臍帶血或胎肝中提�。�。重組抗原是抗原基因在質(zhì)粒體中表達(dá)的蛋白質(zhì)抗原，多以大腸桿菌或酵母菌為質(zhì)粒體。重組抗原的優(yōu)點(diǎn)是除工 程菌成份外，其他雜質(zhì)少，而且無(wú)傳染性，但純化技術(shù)難度較大。以大腸桿菌為質(zhì)粒體的重組抗原如不能充分除大腸桿菌成份，用于ELISA，在反應(yīng)中可出現(xiàn)假 陽(yáng)性，因不少受檢者受大腸桿菌感染而在血清中存在抗大腸桿菌抗體。重組抗原的另一特點(diǎn)是能用基因工程制備某些無(wú)法從天然材料中分離的抗原物質(zhì)。例如丙型肝 炎病毒（HCV）尚不能培養(yǎng)成功，而且丙肝病人血清中HCV抗原含量極微。目前檢測(cè)抗HCV ELISA中所用包被抗原大多為根據(jù)HCV的基因克隆表達(dá)而 制備的重組抗原。在傳染病診斷中，不少重組抗原如HBsAg、HBeAg和HIV抗原等均在ELISA中取得應(yīng)用。合成多肽抗原是根據(jù)蛋白質(zhì)抗原分子的某 一抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其與無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白質(zhì)（BSA）等偶聯(lián)，借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。應(yīng)用多肽抗原的另一 注意點(diǎn)為他僅能檢測(cè)與其相應(yīng)的抗體。一種蛋白質(zhì)抗原往往含有多個(gè)不同的能引起抗體產(chǎn)生的決定簇，因此在受檢血清中的其他抗體就不能與該多肽抗原發(fā)生反應(yīng)。 另外，某些微生物發(fā)生變異時(shí)往往發(fā)生抗原結(jié)構(gòu)變化，在這種情況下，用個(gè)別多肽抗原進(jìn)行包被可引起其他抗體的漏檢。

1.4 包被用抗體
包被固相載體的抗體應(yīng)具有高親和力和高特異性，可取材于抗血清或含單克隆抗體的腹水或培養(yǎng)液。如免疫用抗原中含有雜質(zhì)（即便是極微量的），在抗血清中將 出現(xiàn)雜抗體，必須除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保證試驗(yàn)的特異性�？寡�清不能直接用于包被，應(yīng)先提取IgG，通常采用硫酸銨鹽析和 Sephadex凝膠過(guò)濾法。一般經(jīng)硫酸銨鹽析粗提的IgG已可用于包被，高度純化的IgG性質(zhì)不穩(wěn)定。如需用高親和力的抗體包被以提高試驗(yàn)的敏感性，則 可采用親和層析法以除去抗血清中含量較多的非特異性IgG。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收和親和層析處理，一般可將腹水作適當(dāng)稀 釋后直接包被，必要時(shí)也可用純化的IgG。應(yīng)用單抗包被時(shí)應(yīng)注意，一種單抗僅針對(duì)一種抗原決定簇，在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果。

1.5 　包被的條件
包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定�？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作 為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放 置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的最適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選 定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。

1.6 封閉
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú) 關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。抗原或抗體包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排 斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類(lèi)似。最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或 1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其最大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用， 但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。

封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條 件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌徹底，不經(jīng)封閉也可 得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類(lèi)似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉 一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。

 

2.   酶聯(lián)物（結(jié)合物）
結(jié)合物即酶標(biāo)記的抗體（或抗原），是ELISA中最關(guān)鍵的試劑。良好的結(jié)合物應(yīng)該是 既保有酶的催化活性，也保持了抗體（或抗原）的免疫活性。結(jié)合物中酶與抗體（或抗原）之間有恰當(dāng)?shù)姆肿颖壤�，在結(jié)合試劑中應(yīng)盡量不含有或少含有游離的（未 結(jié)合的）酶或游離的抗體（或抗原）。此外，結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。

2.1   酶
用于ELISA的酶應(yīng)符合以下要求：純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專(zhuān)一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，制備成酶結(jié)合物后仍繼續(xù)保留它的活性部分和催化能力。最好在受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。另外，它的相應(yīng)底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。

在ELISA中，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶 (alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品ELISA試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。國(guó)產(chǎn) ELISA試劑一般都用HRP制備結(jié)合物。HRP是一種糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅 素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶無(wú)色糖蛋白在275nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰，輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在403nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰。HRP的 純度用RZ(Reinheit Zahl，德文，意為純度數(shù)）表示，是403nm的吸光度與280nm吸光度之比，高純度的HRP的RZ≥?.0。

HRP除符合上述的ELISA中標(biāo)記酶的要求外，更有價(jià)格低廉和性質(zhì)較穩(wěn)定的特點(diǎn)。值得注意的是，在選用酶制劑時(shí)，除其純度RZ外，更應(yīng)注意酶的活力。 高純度的酶如保存不當(dāng)，活力也會(huì)降低。酶制劑的活力以所含的酶活力單位表示，可用對(duì)底物作用后生成產(chǎn)物量的測(cè)定進(jìn)行試驗(yàn)。

國(guó)外很多ELISA 試劑采用堿性磷酸酶（AP）作為標(biāo)記酶。常用的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取。不同來(lái)源的酶生化特性特性略不相同，從大腸桿菌中提取的 AP分子量為80000，酶作用的最適合pH為8.0；用小牛腸膜中提取的AP分子量為100000，最適pH為9.6。在ELISA中，AP系統(tǒng)的敏感 度一般高于HRP系統(tǒng)，空白值也較低，但AP價(jià)格昂貴，制備結(jié)合物所得率也較HRP低。

2 .2  抗原和抗體
制備結(jié)合物時(shí)所用抗體 一般 均為純度較高的IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用親和層析純的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反 應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。如用F(ab')2進(jìn)行標(biāo)記，則更可避免標(biāo)本中RF的干擾。在ELISA中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。

2.3  結(jié)合物的制備
酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。
（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，它可以使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。堿性磷酸一般用此法進(jìn)行標(biāo)記。交聯(lián)方法一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與抗體的混合物中，反應(yīng)后即得酶標(biāo)記抗體。

ELISA中常用的酶一般都用此法交聯(lián)。它具有操作簡(jiǎn)便、有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，酶與抗體交聯(lián)時(shí)分 子間的比例不嚴(yán)格，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。諏講椒ㄖ校?br> 先將酶與戊二醛作用，透析除去多余 的戊二醛后，再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。也可先將抗體與戊二醛作用，再與酶聯(lián)結(jié)。兩步法的產(chǎn)物中絕大部分的酶與蛋白質(zhì)是以1:1的比例結(jié)合的，較一步法 的酶結(jié)合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶聯(lián)的有效率較一步法低。

（2）過(guò)碘酸鹽氧化法：本法只適用于含糖量較高的酶。辣根過(guò)氧化物 酶的標(biāo)記常用此法。反應(yīng)時(shí)，過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成Schiff氏堿而結(jié)合。酶標(biāo)記物按克分子比例聯(lián) 結(jié)，其最佳比例為：酶/抗體=1-2/1。此法簡(jiǎn)便有效，一般認(rèn)為是HRP最可取的標(biāo)記方法，但也有人認(rèn)為所有試劑較為強(qiáng)烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重演。 

按以上方法制備的酶結(jié)合物一般都混有未結(jié)合物的酶和抗體。理論上，結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)徹底洗滌，游離 酶可被除去，并不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此制備的酶結(jié)合物應(yīng) 予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好。純化的方法很多，分離大分子化合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法最為簡(jiǎn)便，但效果并不理想，因?yàn)榇朔ㄖ?能去除留在上清中的游離酶，但相當(dāng)數(shù)量的游離抗體仍與酶結(jié)合物一起沉淀而不能分開(kāi)。用離子交換層析或分子篩分離更為可取，高效液相層析法可將制備的結(jié)合物 清晰地分成三個(gè)部分：游離酶、游離抗體和純結(jié)合物而取得最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。

結(jié)合物制得后，在用作ELISA試劑前尚需確定其適當(dāng)?shù)?工作濃度。使用過(guò)濃的結(jié)合物，既不經(jīng)濟(jì)，又可使本底增高；結(jié)合物的濃度過(guò)低，則又影響檢測(cè)的敏感性。所以必須對(duì)結(jié)合物的濃度予以選擇。最適的工作濃度就是 指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。就酶標(biāo)抗體本身而言，它的有效工作濃度 是指與其相應(yīng)抗原包被的載體作試驗(yàn)時(shí)，能得到陽(yáng)性反應(yīng)的最高稀釋度。例如某一HRP：抗人IgG制劑標(biāo)明的工作濃度為1:5000，表示該制劑經(jīng) 1:5000稀釋后，在與人IgG包被的固相作ELISA試驗(yàn)時(shí)，將發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng)。但在用于具體的ELISA檢測(cè)中，酶標(biāo)抗體的最適工作濃度受到固相載體 的性質(zhì)、包被抗原或抗體的純度以及整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)如標(biāo)本、反應(yīng)溫度和時(shí)間等的影響，因此必須在實(shí)際測(cè)定條件下進(jìn)行"滴配"選擇能達(dá)到高敏感度的最大稀釋度作 為試劑盒中的工作濃度。

2.4 　結(jié)合物的保存
酶標(biāo)抗體中的酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，保存不當(dāng)，極易失活。高濃度的結(jié)合物較為穩(wěn) 定，冰凍干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但凍干過(guò)程中引起活力的減低，而且使用時(shí)需經(jīng)復(fù)溶，頗為不便。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油可在低溫冰箱或普 通冰箱的冰格中較長(zhǎng)時(shí)間保存。早期的ELISA試劑盒中的結(jié)合物一般均按以上兩種形式供應(yīng)，配以稀釋液（見(jiàn)3.2.5）臨用時(shí)按標(biāo)明的稀釋度稀釋成工作 液�，F(xiàn)在較先進(jìn)的ELISA試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋?zhuān)��?-8℃保存期可達(dá)6個(gè)月。由于蛋白質(zhì)濃度較低，結(jié)合物易失活， 需加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉），以防止細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.5 　結(jié)合物的稀釋液
用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上，在稀釋緩沖液中常加入高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)（例如1%牛血清白蛋白）， 通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)以抑制結(jié)合物的吸附。一般還加入具有抑制蛋白質(zhì)吸附于塑料表面的非離子型表面活性劑，如吐溫20，0.05%的濃度較為適宜。在間接測(cè)定抗體時(shí)， 血清標(biāo)本需稀釋后進(jìn)行測(cè)定，也可應(yīng)用這種稀釋液。

 

3.1HRP的底物
HRP催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。在ELISA中，DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物，以便作比色測(cè)定。常用的供氫體有鄰苯 二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和 ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅 色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常用的底物。OPD本身難溶于水，OPD·2HCL為水溶性。 曾有報(bào)道OPD有致異變性，操作時(shí)應(yīng)予注意。OPD見(jiàn)光易變質(zhì)，與過(guò)氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定，須現(xiàn)配置現(xiàn)用。在試劑盒中，OPD和H2O2一般 分成二組分，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便。過(guò)氧化氫則配入底物緩沖液中，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸 餾水稀釋。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液，只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用。另 外，TMB又有無(wú)致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸 收波長(zhǎng)為405nm。
ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后，產(chǎn)物顯熒光，可用熒光光度計(jì)測(cè)量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測(cè)定的線性范圍。

HRP對(duì)氫受體的專(zhuān)一性很高，僅作用于H2O2、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)。H2O2應(yīng)用最多，但尿素過(guò)氧化物為 固體，作為試劑較H2O2方便、穩(wěn)定。試劑盒供應(yīng)尿素過(guò)氧化物片劑，用蒸餾水溶解后，在底物緩沖液中密閉、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

3.2　AP的底物
AP為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物，可制成片劑，使用方便。產(chǎn)物為黃色 的對(duì)硝基酚，在405nm波長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光 測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。 

4.     洗滌液 
在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水。

5.     酶反應(yīng)終止液
常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
 
6.    陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品
陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)和陰性對(duì)照品(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì) 照，因此對(duì)照品，特別是陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致。以人血清為標(biāo)本的測(cè)定，對(duì)照品最好也為人血清，因?yàn)檎�常人血清在各種 ELISA模式中可產(chǎn)生不同程度的本底。由于大量正常人血甭較難得到，國(guó)外試劑盒中的對(duì)照品多以復(fù)鈣人血漿 (recalcified human plasma)為原料，即在血漿中加入鈣離子，使其中的纖維蛋白質(zhì)凝固，除去凝塊后所得的液體，其組成與血清相 似。陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)，確定其中不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAg檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。陽(yáng)性對(duì)照品多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)，其中加入一定量的待檢物質(zhì)，此量最好在試劑說(shuō)明書(shū)中標(biāo)明。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱，在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較， 可對(duì)標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量有一個(gè)粗略的估計(jì)。國(guó)外檢測(cè)HBsAg的ELISA試劑盒檢測(cè)敏感度約為0.5ng/ml，陽(yáng)性對(duì)照品中含量約為10ng/ml。 在對(duì)照品中一般加入抗生素和防腐劑，以利保存。

定量測(cè)定的ELISA試劑盒（例如甲胎蛋白質(zhì)癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中。

 

 

substrate ampiification system
AP可催化底物NADP+脫磷酸而生成NAD+(輔酶1)，以乙醇作還原劑，在醇脫氧酶催比下，乙醇脫氫，NAD+還原為NADH，NADH在黃遞酶的催 化下脫氫，同時(shí)四唑鹽(tetrazoliim)被還原成有色的甲蠟(formazan)。AP不斷催化NAD+生成，NAD+與NADH循環(huán)轉(zhuǎn)化，不斷 生成甲蠟。整個(gè)反應(yīng)周期由AP及醇脫氫酶、黃遞酶組成酶級(jí)聯(lián)，每個(gè)AP分子每分鐘可催化生成6X104個(gè)NAD+分子，而每個(gè)NAD+每分鐘又可使60個(gè) 甲臘分子產(chǎn)生。這種由Selfl984年首次報(bào)道的EIA放大系統(tǒng)可使EIA的測(cè)定敏感性提高約250倍。

 

但Brooks等發(fā)現(xiàn)上述底物反應(yīng)循環(huán)中產(chǎn)生的乙醛對(duì)整個(gè)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)有抑制作用，影響放大效果，而當(dāng)加入鹽酸氨基脲時(shí)，則可進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)循環(huán)，從而增加 測(cè)定敏感性，這是因?yàn)辂}駿氨基脲可與乙醛反應(yīng)生成縮氨基脲(semicarbatone)和水，這樣就消除了乙醛對(duì)反應(yīng)的抑制阼用。應(yīng)用這種改進(jìn)方法測(cè)定 食物中含蛋白A的金黃色葡萄球菌，測(cè)定敏感性從Self原方法的(4～6)X103菌落形成單位(c．{．u)/g或m1，到20個(gè)菌落形成單位 (c．f．u)/g或ml，測(cè)定敏惑性約提高200—300倍。

 

后來(lái)Self等又用刃天青(resazurin)代替其原來(lái)放大模式中的四唑鹽，刃天青在黃遞酶的作用下成為發(fā)出熒光的resorufin，然后使用熒光比色計(jì)測(cè)定得到結(jié)果。這種方式的測(cè)定敏感性也較原始方法大為提高，每孔內(nèi)僅含約350個(gè)AP分子也可測(cè)出。

 

dual-enzyme cascade雙酶級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)又稱酶抑制級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，酯酶抑制劑4—(3—氧—4，4，4—三氟丁基)苯磷駿鹽因其帶有封閉性—P04基團(tuán)，對(duì)酯酶不具抑制活性，但 當(dāng)其在AP作用下脫—PO4基時(shí)，失活的抑制劑即成為具活性的抑制劑，使加入的羧酸酯酶失活，通過(guò)顯色反應(yīng)測(cè)定殘留的酯酶活性即可知原始AP的活性，二者 成反比相關(guān)。這種放大系統(tǒng)的測(cè)定敏感性較普通方法可提高約125倍。

 

enzymeactivationcascade這亦是一種以AP為標(biāo)記酶的放大系統(tǒng)。黃素—腺嘌呤二核苷酸磷酸(FADP)在AP的催化下脫磷酸為FAD，F(xiàn)AD則使脫輔基的氨基酸氧化酶轉(zhuǎn)化為全酶的 氨基酸氧化酶，后者催化晡氨酸生成H2O2，于是在DCHBS，4AAP及HRP存在下，得到有色產(chǎn)物。上述放大系統(tǒng)可測(cè)定l{mol/LAP。

此外，催化指示物沉著(catalyzedreporterdeposition，CARD)也是一種多酶級(jí)聯(lián)EIA放大系統(tǒng)。HRP氧化生物素或熒光素 標(biāo)記的酪胺所產(chǎn)生的游離基，可與固相上蛋白的酪氨酸、色氨酸反應(yīng)而使大量的生物素或熒光素沉著于固相上HRP周?chē)�的區(qū)域內(nèi)，沉著的生物素可用HRP及6— 半乳糖苷酶或AP標(biāo)記的鏈霉親合素測(cè)定，沉著的熒光素則可用酶標(biāo)抗熒光素測(cè)定。這樣使得一分子HRP轉(zhuǎn)化為大量的標(biāo)記物，從而大為改善(約30倍)EIA 的測(cè)定敏感性。Diamandis等使用螯合的Eu3+鏈霉親合素—甲狀腺球蛋白試劑替代上述酶標(biāo)物測(cè)定AFP，不但提高了測(cè)定敏感性，而且也使背景“噪 聲”較普通方法改善了6～8倍。我們將上述CARD放大系統(tǒng)直接用于HBsAg商品ELISA試劑盒，在不改變商品試劑盒任何成分和操作步驟的情況下，可 將試劑盒的測(cè)定敏感性提高約5倍。

 

脂多糖(1ipopolysaccharide，LPS)可激活鱟血細(xì)胞裂解物的凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)。首先LPS使因子C激活為C，后者又激活因子B為B，B使 前凝固酶轉(zhuǎn)化為凝固酶，凝固酶則催化底物(Boc-Le，u-Gly-Arg-p)產(chǎn)生有色的對(duì)硝基苯胺(曠 nitroa·niline，PNA)，A405nm測(cè)定。因此，在免疫測(cè)定中，如以LPS作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，則可通過(guò)上述反應(yīng)使測(cè)定敏感性放大，可檢 出10-7～10-11g／m1的IgG和10-7～10-11g／ml的抗IgG，Seki等將上述方法用于雙夾心法檢測(cè)HBsAg，敏感性達(dá) 10-10～10-12g／ml。

 

一般來(lái)說(shuō)，在酶免疫測(cè)定中，限制測(cè)定敏感性的一個(gè)重要因素是非特異地結(jié)合于固相的標(biāo)記酶的顯色反應(yīng)，因其會(huì)使背景顯色加深，從而掩蓋了低濃度待測(cè)物所致的 特異顯色，解決這個(gè)問(wèn)題提高測(cè)定敏感性的一條途徑是將待測(cè)物——抗體—酶復(fù)合物從固相上洗提至另一個(gè)固相，使用一雙標(biāo)抗體[如生物素和二硝基苯(DNP) 標(biāo)記的抗體]和一酶標(biāo)抗體即可達(dá)到這個(gè)目的，在液相中形成的免疫復(fù)合物(雙標(biāo)抗體：抗原：抗體：酶)捕獲于DNPIgG包被的聚苯烯珠上，洗滌后，使用二 硝基苯—L—賴氨酸將其從固相上取代下來(lái)，然后再將上述免疫復(fù)合物捕獲于鏈霉親合素包被的聚苯烯珠上，最后進(jìn)行酶反應(yīng)顯色測(cè)定。Hashida和 shikawa使用該方法測(cè)鐵蛋白敏感性達(dá)到1zeptomole(1X10-21mol，約600個(gè)分子)，較常規(guī)方法提高了30倍。眾多的研究者用該 方法測(cè)定抗甲狀腺球蛋白IgC及抗HTLV—1 IgG和抗HIV-1 IgG，敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)地超過(guò)常規(guī)方法，取得了良好的效果。

 

此外，Domingo和Marco等在進(jìn)行點(diǎn)免疫結(jié)合試驗(yàn)時(shí)，以4—氯—1—萘酚作為HRP的底物，反應(yīng)后得到的不可溶產(chǎn)物因其具有特殊的紫外吸收及熒光 幻滅特征而可在紫外燈下觀察結(jié)果。由于沉著于膜上的物質(zhì)是HRP反應(yīng)的中間產(chǎn)物，而非可見(jiàn)光下能見(jiàn)到的最終產(chǎn)物，所以可大幅度地提高這種固相免疫測(cè)定的敏 感性，較常規(guī)方法約增加100倍。至于酶脂質(zhì)體放大系統(tǒng)(1iposomeamplificationsystem)，也是一種新型高效的EIA測(cè)定放大 系統(tǒng)。

 

綜上所述，EIA測(cè)定放大方式雖然多種多樣，且不斷推陳出新，但研究者的出發(fā)點(diǎn)無(wú)非是一方面極力降低影響測(cè)定敏感性的非特異顯色，如通過(guò) 增加操作步驟而達(dá)到上述目的的免疫復(fù)合物轉(zhuǎn)移兩位點(diǎn)酶免疫試驗(yàn)；另一方面則是通過(guò)質(zhì)量提高的信號(hào)，從而達(dá)到提高敏感性的目的，如增加反應(yīng)層次的生物素—親 合素，多酶級(jí)聯(lián)等放大系統(tǒng)。但嚴(yán)格地講，真正稱得上是EIA測(cè)定放大系統(tǒng)的僅限于后者，前者還只能說(shuō)是一種所謂的超敏感 EIA(uhrasensitive enzyme immunoassay)。至于利用酶反應(yīng)產(chǎn)物特征改變檢測(cè)手段(如發(fā)光或熒光檢測(cè))而使EIA測(cè)定敏感性提高，則只不過(guò)是依靠?jī)x器開(kāi)闊了“視野“而已。