microRNA RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法介紹

Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR

傳統(tǒng)實(shí)時(shí)定量RT PCR只能檢測(cè)到miRNA前體，而Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR技術(shù)可以解決這一問題。Stem loop實(shí)時(shí)定量RT PCR是一項(xiàng)高特異度、敏感度的檢測(cè)miRNA表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括設(shè)計(jì)具有莖環(huán)（stem loop）結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物和用miRNA熒光標(biāo)記的特異分子探針進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 二個(gè)關(guān)鍵步驟。該技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):高度特異性，對(duì)序列高度同源的miRNA也可精確區(qū)分；超寬的定量線性范圍和高度的檢測(cè)靈敏度；樣品消耗少，僅需1～10 ng的總RNA；適用范圍廣，總RNA、細(xì)胞裂解物以及純化的RNA都可用于miRNA的定量檢測(cè)。

Stem-loop實(shí)時(shí)定量RT PCR基本原理： microRNA的RT-PCR一般使用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物，這種具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物針對(duì)所需檢測(cè)的目的microRNA設(shè)計(jì)，具有特異的序列，結(jié)構(gòu)示意圖如下所示。內(nèi)參使用的是小RNA U6，U6的反轉(zhuǎn)錄使用的是隨機(jī)引物。將反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物作為real-time PCR的模板，檢測(cè)目的microRNA的引物是針對(duì)目的microRNA的特異的上下游引物，檢測(cè)內(nèi)參使用的是針對(duì)U6的特異的上下游引物。

實(shí)驗(yàn)過程

1、用Trizol抽提t(yī)otal RNA，抽提方法同普通的RNA的Trizol抽提，只是在用異丙醇處理時(shí)需要4℃ 過夜。將抽提得到的RNA置于-80℃保存。

2、將抽提的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄的體系一般使用12.5ul的體系。具體的體系如下：

A: RNase free water

B: Total RNA: 0.625ug

C: Impron buffer: 2.5ul

D: dNTPs: 2.5ul

E: RNase inhibitor: 0.625ul

F: Impron Mgcl2: 1.5ul

G: Primer: 0.5ul

H：Reverse transcriptase: 0.625ul

具體的操作是事先計(jì)算好需要的模板量，以及所要的RNase free water的量，在PCR小管中加好需要的模板量以及RNase free water的量，并將剩下的模板立即置于－80℃保存。再按照反轉(zhuǎn)錄的體系做好總的MIX，再分裝到每個(gè)PCR小管內(nèi)。將PCR小管置于PCR儀上反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)的具體程序如下： 25℃ 5 min ,42℃ 60 min ,70℃ 15 min. 4℃儲(chǔ)藏

3、    反轉(zhuǎn)錄的cDNA作為real-time PCR檢測(cè)的模板，由于real-time PCR檢測(cè)靈敏性，要求每個(gè)樣需要三個(gè)重復(fù)。每一個(gè)反應(yīng)的用量如下：

1.                         SYBR 5.0ul

2.                         Primer mix 0.2ul

3.                         cDNA 1.0ul

4.                         water 3.8ul

4、在八連管中先加入模板，加入3.4ul的cDNA模板。

5、 根據(jù)需要檢測(cè)樣本的個(gè)數(shù)，計(jì)算所需要的SYBR、Primer mix、water量，具體的計(jì)算過程為：試劑單反應(yīng)量X檢測(cè)樣本個(gè)數(shù)X3.4 ,根據(jù)計(jì)算需要的量制作MIX 。將MIX加入每個(gè)八連管的小管中。

6、    將對(duì)應(yīng)的每個(gè)八連管的小管取出10ul加入96孔板，每個(gè)小管對(duì)應(yīng)96孔板的3個(gè)孔，即3個(gè)重復(fù)孔。

7、  加完樣品后，用專用的封膜覆蓋96孔板，用專用的刮板覆蓋嚴(yán)實(shí)。

8、上機(jī)檢測(cè)。具體PCR程序如下：

1：50℃ 2 min ;

2：95℃ 5 min ;

3：95℃ 30 s ;

4：60℃ 40 s ;

5：72℃ 30 s ;

6：95℃ 15 s ; 60℃ 30s ;95℃ 15 s .</OL< ol>

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1、由于real-time PCR的檢測(cè)十分靈敏，因此它對(duì)RNA定量的準(zhǔn)確性要求較高，一般RNA的定量多采用3復(fù)孔定量。

2、    無論在反轉(zhuǎn)錄或real-time PCR加樣時(shí)要求加樣一定要準(zhǔn)確。

3、    在將八連管的mix加入96孔板前一定要充分混勻，一般采取的策略是將八連管一剪為二，置于Vortex上振蕩混勻，Vortex的轉(zhuǎn)速不要太高，以免將管內(nèi)的液體濺到蓋子內(nèi)。

miRNA靶基因的鑒定

目前鑒定靶基因最直接的方法是, 利用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染或敲低miRNA后細(xì)胞中mRNA水平及蛋白水平的變化, 從而確定miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系. 這種方法可以大大提高準(zhǔn)確率，但最終確定靶基因，還需要鑒定miRNA的靶位點(diǎn). 而miRNA的靶位點(diǎn)的鑒定最常用的方法是熒光素酶報(bào)告基因法. 其基本原理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體, 將希望鑒定的miRNA靶基因的3?UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3’UTR中, 然后將熒光素酶基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平, 最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3’UTR中是否含有miRNA的靶位點(diǎn)。