激光掃描影像系統(tǒng)在3D腫瘤球體或干細(xì)胞克隆球體快速檢測和分析中的應(yīng)用

    發(fā)現(xiàn)新的抗癌藥物的研究目前正面臨著重要的挑戰(zhàn)，因為在臨床前研究顯示有效果的化合物只有5％的能繼續(xù)被開發(fā)，成為獲得許可的藥物。傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)模型在藥物發(fā)現(xiàn)過程的早期階段被用于評估候選藥物，然而，有越來越多的證據(jù)表明，在二維單層生長的細(xì)胞并不能準(zhǔn)確地反映腫瘤的生物學(xué)復(fù)雜性。

 

    對兼容高通量篩選的更好的體外模型的需求引導(dǎo)了3D細(xì)胞培養(yǎng)模型的發(fā)展，尤其是多細(xì)胞微球，其將保留腫瘤的許多形態(tài)學(xué)和遺傳性狀。在體外實驗中，3D培養(yǎng)模型被廣泛地認(rèn)為相比2D形式的培養(yǎng)系統(tǒng)是更加具有生理相關(guān)性的模型。3D模型更加準(zhǔn)確地反映了體內(nèi)微環(huán)境中的復(fù)雜性，并被用于許多的研究領(lǐng)域，比如腫瘤學(xué)[1]，肝臟毒性[2]，神經(jīng)生物學(xué)[3]，胰腺研究[4]，腎臟學(xué)[5]，以及干細(xì)胞研究[6]。這些研究顛覆了我們對體外培養(yǎng)中以及體內(nèi)的細(xì)胞行為學(xué)的認(rèn)識。然而，由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的限制，以3D培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行高通量篩選卻發(fā)展地非常緩慢。技術(shù)瓶頸包括實驗的異質(zhì)性、低通量、難以實現(xiàn)自動化以及昂貴的成本。

 

        在這里，我們描述通過兩種方法進(jìn)行3D培養(yǎng)的細(xì)胞球體檢測：1）在超低附著板中；2）在半固體瓊脂上。這兩種方法都可在96和384孔微孔板形式上進(jìn)行。

 

    我們隨后用Acumen hci激光掃描技術(shù)進(jìn)行快速的整板圖像采集（5分鐘/塊），給出一系列參數(shù)，例如球體的數(shù)量、面積和體積。Acumen hci是適于對微球體進(jìn)行高內(nèi)涵分析的完美系統(tǒng)，它獨有的全孔掃描能力可一次采集單孔中不同位置所有微球體的信息，而具有一定景深的掃描鏡使得可對孔中處于各層的球體也一次捕獲，對單個球體體積進(jìn)行統(tǒng)計而無需對其進(jìn)行Z層斷層掃描，多次采集數(shù)據(jù)。

 

 

A：   在超低粘附板中形成腫瘤微球體

Corining的超低粘附板，采用不透明的壁和清晰、圓形的孔底。專有的超低細(xì)胞粘附涂層，具有親水性、生物惰性的和不可降解的特性，通過共價連接到孔底部的內(nèi)表面上。這種對培養(yǎng)孔底部獨特的設(shè)計，使3D細(xì)胞球體培養(yǎng)物可高度可重復(fù)地生長。不透明的側(cè)壁和專有板底網(wǎng)格形式的設(shè)計大大降低了熒光、冷光背景和孔與孔之間的串?dāng)_。在孔中，球狀體可以生成，培養(yǎng)，并進(jìn)行熒光或者冷光信號的檢測，而無需將球狀體轉(zhuǎn)移。目前，Corning超低粘附板具有96孔和384孔板形式，這兩種板型都很方便進(jìn)行自動化。   a) 將懸浮于完全培養(yǎng)基中的肝癌細(xì)胞株HepG2的單細(xì)胞鋪板于Corning超低粘附板中（#4520&3830），鋪板密度為96孔板每孔200μl含有300個細(xì)胞，384孔板中每孔50μl含有300個細(xì)胞 b) 在24小時內(nèi)，懸浮的細(xì)胞將組裝成單個3D微球，沉淀在細(xì)胞中央，如右圖Figure1A所示 c) 72小時后，將50%的培養(yǎng)基更換成含有2倍濃度的Doxorubicin（阿霉素）的新鮮培養(yǎng)基，更換后終濃度為316pM~3.16μM d) 形成的微球體繼續(xù)培養(yǎng)6天

Figure 1A

 

	96孔板	384孔板	Figure 1B
基底層（含0.6%瓊脂的培養(yǎng)基）	25μl	10μl
細(xì)胞層（含0.4%瓊脂的單細(xì)胞懸液）	50μl含有500個細(xì)胞	20μl含有150個細(xì)胞
培養(yǎng)基覆蓋層	75μl	30μl
a) 按照以上體系進(jìn)行軟瓊脂的配制 b) 將含有單細(xì)胞的軟瓊脂培養(yǎng)于37度培養(yǎng)箱 c) 24小時后，將5μl的Doxorubicin（阿霉素）加入孔中，終濃度為1nM~1μM d) 繼續(xù)培養(yǎng)微球體4天，3天更換一次含有阿霉素的覆蓋層培養(yǎng)基

 

C：染色和圖像采集

a) 在含有細(xì)胞微球的孔中加入染料Calcein-AM（終濃度為5μM）對兩種方法形成的腫瘤微球體進(jìn)行染色，染料加入后在37度孵育1小時 b) 板子隨后用Acumen進(jìn)行圖像采集（每板的圖像采集和數(shù)據(jù)輸出需要5分鐘） c) 數(shù)據(jù)是在線分析的，在掃描圖像的同時即獲得了，得出的報告含有球體的數(shù)量、面積和體積、熒光強(qiáng)度等等信息

Figure 1C

                                          

A          96孔板
	Figure 2A: 生長在96孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。2B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=6）
B	C

 

A          384孔板
	Figure 3A:生長在384孔超低粘附板中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像底部顯示了加入每孔的阿霉素濃度。3B-C：藥物量效曲線（mean±SEM，n=8）
B	C

 

 

A	B	C
	D
		Figure 4A: 生長在96孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。4B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=3）

 

A	B	C
	D
		Figure 5A: 生長在384孔板軟瓊脂中的HepG2腫瘤微球體的全孔TIFF圖像，圖像上顯示了加入每孔的阿霉素濃度。5B-D：藥物量效曲線（mean±SEM，n=4）

 

 

        生長在 3D培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞群體、不同細(xì)胞類型、微組織結(jié)構(gòu)相互協(xié)調(diào)、相互作用，模擬了生命物質(zhì)在體內(nèi)微環(huán)境中的真實生存環(huán)境，為研究者對疾病的剖析和攻克提供了高質(zhì)量的數(shù)據(jù)信息。我們在96和384微孔板中建立了兩種簡單且穩(wěn)定的進(jìn)行腫瘤微球體3D培養(yǎng)的方法，通過染色和圖像采集，獲得數(shù)目、面積、體積和熒光強(qiáng)度等信息。藥物量效曲線的一致性結(jié)果體現(xiàn)了兩種方法的可靠性和可重復(fù)性，這些數(shù)據(jù)表明acumen hci激光掃描系統(tǒng)是對基于兩種培養(yǎng)系統(tǒng)獲得的腫瘤微球體進(jìn)行高通量（5分鐘/板）分析的理想平臺，該平臺在過去的研究中已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于腫瘤學(xué)[7-9]和干細(xì)胞研究領(lǐng)域[10-12]。

 

 

1. Maria V, Sharon G, Frances B, et al. Advances in establishment and analysis of three dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biology, 2012, 10:29

 

2. Patricio G, Nicola J H, Ute A, et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Arch. Toxicol, 2013, 87(8): 1315-1530

 

3. Yinzhi L, Amish A, Ke Ch, et al. Neural Cell 3D Microtissue Formation is Marked by Cytokines’ Up-Regulation. PLoS One, 2011, 6(10): e26821

 

4. Yesl J, Ah R K, Jae S L. 3D co-culturing model of primary pancreatic islets and hepatocytes in hybrid spheroid to overcome pancreatic cell shortage. Biomaterials, 2013, 34(15): 3784-3794

 

5. Anna I A, Brenda K M, Glen D P, et al. A 3-D organoid kidney culture model engineered for high-throughput nephrotoxicity assays. Biomaterials, 2012, 33(18): 4700-4711

 

6. Sasai Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell, 2013, 12(5): 520-530

 

7. Weijuan W, Chen Bi, Kelly M C, et al. Inhibition of tumor growth and metastasis in non-small cell lung cancer by LY2801653, an inhibitor of several oncokinases, including MET. Clin Cancer Res, 2013, 19(20): 5699–5710

 

8. Kai W, Ho Y L, Shephanie S, et al. Genomic Landscape of Copy Number Aberrations Enables the Identification of Oncogenic Drivers in Hepatocellular Carcinoma. Hepatology, 2013, 58(2): 706-717

 

9. Shane R H, Jeremy T, Anthony P O, et al. An HTS-Compatible 3D Colony Formation Assay to Identify Tumor-Specific Chemotherapeutics. J Biomol Screening, 2013, 18(10): 1298-1308

 

10. Koppany V, Hydeyuki O, Robert D, et al. A molecular screening approach to identify and characterize Inhibitors of glioblastoma stem cells. Mol Cancer Ther, 10(10), 1818-1828

 

11. Anne D, Jimmy E, Richard J S, et al. CXCR4 Expression in Prostate Cancer Progenitor Cells. PLoS One, 2012, 7(2): e31226

 

12. Claudia P, Ina K, Leoni K. Discovery of the cancer stem cell related determinants of radioresistance. Radiother Oncol, 2013, 108(3), 378-387