人全血Foxp3實(shí)驗步驟

需要試劑

1. Human Regulatory T Cell Whole Blood Staining Kit （#88-8996-40）

包含組分：

(1)、1X RBC Lysis Buffer: 200 mL
(2)、Flow Cytometry Staining Buffer: 600 mL
(3)、Fixation/Permeabilization Concentrate: 30 ml
(4)、Fixation/Permeabilization Diluent: 100 mL
(5)、Anti-Human Foxp3 PE (PCH101): 25 tests

• Anti-human CD4 （標(biāo)記可選）
• Anti-human CD25（標(biāo)記可選）
• Rat IgG2a K Isotype Control PE (#12-4321-41)

推薦操作步驟

1. 取100ul全血，加入適量Anti-human CD4和Anti-human CD25，4 ℃孵育30 分鐘（根據(jù)說明書和抗體管上的標(biāo)識確定抗體用量）。按個人要求設(shè)置空白管、補(bǔ)償管、同型對照管和樣本管。 
2. 染色完的全血不用洗，每管加入2-3ml 1X RBC Lysis Buffer，混勻。室溫孵育10分鐘。
3. 觀察溶液透亮后，300 -400 g離心5分鐘，去上清。
4. 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g離心5分鐘，去上清。
5. 重復(fù)洗一次。
6. 制備固定/破膜工作液：1份Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3份Fixation/Permeabilization Diluent中，按樣品量現(xiàn)用現(xiàn)配，每管用量為1ml。
7. 旋渦震蕩細(xì)胞沉淀，每管加入1ml的固定/破膜工作液（第6步配置準(zhǔn)備的），并再次旋渦混勻。
8. 避光4℃孵育30分鐘到60分鐘，在此時間內(nèi)效果一致。
9. 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g離心5分鐘，去上清。
10. 重復(fù)洗一次。
11. 樣本管中加入5ul或1test的Foxp3抗體，同型對照管中加入0.25ug Rat IgG2a K Isotype Control PE，保證最終染色體積不大于100ul，避光4℃孵育30-60分鐘，根據(jù)結(jié)果優(yōu)化染色時間。
12. 加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer洗滌細(xì)胞并棄去上清液。
13. 用300-500ul Flow Cytometry Staining Buffer重懸細(xì)胞，并上機(jī)檢測并分析。注：由于染色過程中使用了細(xì)胞固定和破膜，對比起活細(xì)胞在形態(tài)上會有一定變化，因此FSC/SSC圖中圈門時需要做一定調(diào)整。                 

注：以上說明書僅供參考，具體實(shí)驗請對照廠商說明書操作。