如何在構建敲除細胞株時利用好CRISPR/Cas9技術？
從 2013 年 1 月份開始到現(xiàn)在，近 2 年的時間里，CRISPR/Cas9 技術的應用領域被來自全球優(yōu)秀的科學家們不斷的擴大。其中包括基因敲除，定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位和 CHIP 等多個領域，而且這個技術的應用領域還在不斷的被擴大。
吉銳生物基于多年的基因重組經(jīng)驗（系統(tǒng)的研究過 ZFN / IOS / TALEN / CRISPR 重組技術），以及采用 CRISPR/Cas9 技術構建超過 50 多個株系的經(jīng)驗，重點談一談構建敲除細胞株系時，如何利用好 CRISPR/Cas9 技術。相比于其它重組技術，使用 CRISPR/Cas9 技術做基因敲除是效率最高，成本最低的技術。其中的關鍵因素無異于下面幾點：
1) 明確需要敲除的基因序列
首先需要明確內(nèi)含子和外顯子序列；可以登錄 NCBI 或者 UCSC 的網(wǎng)站可以方便的查到；
2) 合適的靶位點選擇
一般建議設計 2-3 條，然后轉染到細胞中，用 Cruiser™ 和測序的方法驗證哪個靶位點的活性最好；也可以登錄 CRISPR/Cas9 敲除載體庫：（查看載體庫詳細頁） 看看是否有自己要研究的基因，這個載體庫中的靶位點都是在細胞體內(nèi)經(jīng)過活性驗證，保證敲除活性的；
3) 敲除載體選擇
根據(jù)需要可以選擇空載體，帶抗性的載體（Puro/Neo），帶熒光標記的載體（EGFP/RFP），雙敲除載體等。其中空載體較�。�8K），可以提高轉染的效率；抗性便于后面進行抗性篩選，熒光標記的載體便于進行流式分選；
4) 單細胞生長
不同的細胞單個細胞的生長情況不一樣。有的細胞長的快，有的細胞長的慢，有的單個細胞幾乎就不長。這個就需要采取不同的方案了，這里推薦一個單細胞培養(yǎng)的小耗材：Cell Plaza™。設計精巧，采用的是共培養(yǎng)的原理，如果碰到不好長的單個細胞，可以試一試。同時，這個對于植物細胞做敲除時的小愈傷的生長很有幫助。從事植物基因敲除方向的研究人員，也可以試一試；
5) 陽性克隆篩選
關于這個部分可以參考吉銳生物自主研發(fā)的產(chǎn)品——Cruiser™ 基因敲除檢測試劑盒。它能簡便高效的檢測基因敲除效率和基因多態(tài)性，尤其適用于 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9 實驗中混合樣本的突變效率的檢測以及陽性克隆的篩選�？芍^陽性克隆篩選的不二選擇（查看Cruiser™詳細介紹）除了敲除外，CRISPR/Cas9還可以應用在定點突變，定點整合，基因沉默，基因定位等各個方向，每個方向都有不同的細節(jié)需要把握。這里就不一一闡述，如果需要了解更多其它信息，可以隨時和我們聯(lián)系。也可關注吉銳生物官方微信（微信號：Genloci），參與互動。
