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案例分享: Agilent miRNA芯片在各類樣本中的應(yīng)用

瀏覽次數(shù)：4009　發(fā)布日期：2015-3-31　來源：上海伯豪生物技術(shù)有限公司

1.新鮮組織樣本

新鮮組織一般包括以人類疾病診斷及治療為目的，經(jīng)患者或健康人同意后，從患者的機(jī)體中切取的未經(jīng)特殊化學(xué)試劑處理的病變組織或相鄰健康組織，或者健康人的相同部位的對(duì)照組織。這些人類疾病相關(guān)的新鮮組織樣本的整理、保存、研究對(duì)于提高疾病的診斷質(zhì)量、促進(jìn)臨床工作、探討及研究疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。此外，新鮮組織樣本還包括從其他物種的機(jī)體中切取的未經(jīng)特殊化學(xué)試劑處理的樣本。采用新鮮組織樣本，并使用Agilent miRNA芯片，可以對(duì)新鮮樣本的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行及時(shí)直接的監(jiān)測(cè)，從而對(duì)疾病，或者動(dòng)植物的不同發(fā)育階段，不同器官的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行研究，了解miRNA的表達(dá)趨勢(shì)變化，和相應(yīng)的功能。上海伯豪生物技術(shù)有限公司為客戶提供了多年優(yōu)質(zhì)的Agilent miRNA芯片服務(wù)，發(fā)表了一系列相關(guān)論文。

伯豪案例選摘：

肺癌組織樣本：

Huang W, Hu J, Yang DW, Fan XT, Jin Y, Hou YY, Wang JP, Yuan YF, Tan YS, Zhu XZ, Bai CX, Wu Y, Zhu HG, Lu SH. Two MicroRNA Panels to Discriminate Three Subtypes of Lung Carcinoma in Bronchial Brushing Specimens. Am J Respir Crit Care Med2012 Dec 1;186(11):1160-7.

大腸癌組織樣本：

Wang S, Wang L, Bayaxi N, Li J, Verhaegh W, Janevski A, Varadan V, Ren Y, Merkle D, Meng X, Gao X, Wang H, Ren J, Kuo WP, Dimitrova N, Wu Y, Zhu H. A microRNA panel to discriminate carcinomas from high-grade intraepithelial neoplasms in colonoscopy biopsy tissue. Gut. 2013 Feb;62(2):280-9.

腎細(xì)胞癌組織：

Chen X, Wang X, Ruan A, Han W, Zhao Y, Lu X, Xiao P, Shi H, Wang R, Chen L, Chen S, Du Q, Yang H, Zhang X. miR-141 Is a Key Regulator of Renal Cell Carcinoma Proliferation and Metastasis by Controlling EphA2 Expression. Clin Cancer Res. 2014 20: 2617-30.

子宮頸癌組織：

Ke G, Liang L, Yang JM, Huang X, Han D, Huang S, Zhao Y, Zha R, He X, Wu X. MiR-181a confers resistance of cervical cancer to radiation therapy through targeting the pro-apoptotic PRKCD gene. Oncogene 2013 Jun 20;32(25):3019-27.

大鼠神經(jīng)組織：

Yu B, Zhou S, Wang Y, Qian T, Ding G, Ding F, Gu X.miR-221/222 promote Schwann cell proliferation and migration by targeting LASS2 following sciatic nerve injury. J Cell Sci. 2012 Jun 1;125(Pt 11):2675-83.

小鼠大腸癌模型組織：

Gao Y, Li X, Yang M, Zhao Q, Liu X, Wang G, Lu X, Wu Q, Wu J, Yang Y, Yang Y, Zhang Y. Colitis-Accelerated Colorectal Cancer and Metabolic Dysregulation in a Mouse Model. Carcinogenesis. 2013 Aug;34(8):1861-9.

2.FFPE樣本

使用芯片技術(shù)研究miRNA通常需要使用新鮮的樣本或快速冷凍的樣本。但是世界上大約有數(shù)十億份組織樣品保存在醫(yī)院或者組織樣品庫中，絕大多數(shù)是使用福爾馬林固定石蠟包埋的方法處理(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，F(xiàn)FPE)的樣品。數(shù)量巨大的樣品蘊(yùn)含著無限的科學(xué)研究的機(jī)會(huì)同時(shí)也是研究者們很棘手的研究對(duì)象。如何從這些樣品中獲取我們需要的生物信息呢？ Queen’s Cancer Research Institute的研究者使用Agilent miRNA芯片對(duì)快速冷凍的樣本以及與之相匹配的相應(yīng)的FFPE樣本進(jìn)行了研究。結(jié)論證實(shí)：檢測(cè)FFPE樣本中的miRNA在技術(shù)上是可行的；Agilent miRNA芯片平臺(tái)的數(shù)據(jù)顯示出其在抽提、標(biāo)記和雜交過程中的高度重復(fù)性。

利用Agilent miRNA芯片可以對(duì)FFPE樣本進(jìn)行miRNA的表達(dá)譜研究，為挖掘FFPE樣本的巨大應(yīng)用價(jià)值提供了新的方法。

伯豪案例選摘：

Fang Y, Yu X, Liu Y, Kriegel AJ, Heng Y, Xu X, Liang M, Ding X. miR-29c is downregulated in renal interstitial fibrosis in humans and rats and restored by HIF-α activation. Am J Physiol Renal Physiol. 2013, 304(10):F1274-82.

3. 細(xì)胞樣本

細(xì)胞作為常用的實(shí)驗(yàn)材料，在生物及臨床研究中被廣泛應(yīng)用，尤其是對(duì)于癌癥的研究具有重要意義。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以把來自機(jī)體的組織經(jīng)分散成為單個(gè)細(xì)胞，放在類似于體內(nèi)的體外環(huán)境中生長(zhǎng)、繁殖或傳代，從而用于觀察細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象。細(xì)胞可以用于細(xì)胞工程與細(xì)胞癌變等重要問題的研究。癌細(xì)胞體外培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理和癌細(xì)胞行為的主要方法，為腫瘤病因?qū)W、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和藥理學(xué)等研究提供便利的條件。細(xì)胞的癌化可能與原癌基因的活化或者抑癌基因的功能受阻有關(guān)。MiRNA作為重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，可以起到類似抑癌基因或者原癌基因的作用，也因此通過腫瘤細(xì)胞樣本，可以對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展或轉(zhuǎn)移過程中的miRNA表達(dá)進(jìn)行研究，使用Agilent miRNA芯片可以研究腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)譜，對(duì)腫瘤或其他細(xì)胞中miRNA相關(guān)功能研究提供了理想工具。

伯豪客戶利用Agilent miRNA芯片技術(shù)，檢測(cè)了多種腫瘤細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜，通過與正常細(xì)胞的比較，發(fā)現(xiàn)miRNA可以參與多種腫瘤細(xì)胞的調(diào)控，為研究腫瘤產(chǎn)生的分子機(jī)制和藥物治療提供了重要信息。

伯豪案例選摘：

乳腺癌細(xì)胞系：

Cai J, Guan H, Fang L, Yang Y, Zhu X, Yuan J, Wu J, Li M. MicroRNA-374a activates Wnt/β-catenin signaling to promote breast cancer metastasis. J Clin Invest. 2013 Feb; 123(2):566-79.

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系：

Jiang L, Lin C, Song L, Wu J, Chen B, Ying Z, Fang L, Yan X, He M, Li J, Li M. MicroRNA-30e* promotes human glioma cell invasiveness in an orthotopic xenotransplantation model by disrupting the NF-κB/IκBα negative feedback loop. J Clin Invest. 2012, 122(1):33-47.

肝癌細(xì)胞系：

Zhu K, Pan Q, Zhang X, Kong LQ, Fan J, Dai Z, Wang L, Yang XR, Hu J, Wan JL, Zhao YM, Tao ZH, Chai ZT, Zeng HY, Tang ZY, Sun HC, Zhou J. MiR-146a enhances angiogenic activity of endothelial cells in hepatocellular carcinoma by promoting PDGFRA expression. Carcinogenesis. 2013, 34(9):2071-9.

4.細(xì)胞微粒Microparticles

細(xì)胞微粒(microparticles, MPs),也稱微囊泡,是各類細(xì)胞遭受一系列應(yīng)激(激活或凋亡)時(shí),從細(xì)胞漿膜上脫落而釋放的一些膜性小囊泡.研究證實(shí),紅細(xì)胞、白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等均可釋放細(xì)胞微粒,并以其細(xì)胞表面標(biāo)記來分類這些微粒.它是一種球形結(jié)構(gòu)的、直徑在0.1～1μm的異源群體,攜帶有其親代細(xì)胞的特異性抗原的磷脂囊泡,通過出芽方式釋放.健康人外周血中也存在一定微粒,其中血小板來源的微粒占總體的70%～90%。研究正常健康人群和腫瘤患者的細(xì)胞微粒的miRNA表達(dá)譜，也可以找到細(xì)胞微粒中特有的miRNA特征物，從而研究腫瘤的類型及相關(guān)發(fā)生機(jī)制。

伯豪案例選摘：

Li D, Jia H, Zhang H, Lv M, Liu J, Zhang Y, Huang T, Huang B.

TLR4 signaling induces the release of microparticles by tumor cells that regulate inflammatory cytokine IL-6 of macrophages via microRNA let-7b.Oncoimmunology. 2012, 1(5):687-693.

5.血漿/血清樣本

人體除了一般的細(xì)胞組織會(huì)表達(dá)miRNA之外，研究還表明在血清血漿內(nèi)，miRNA一般不會(huì)被內(nèi)源性RNase 降解，且在惡劣的條件下（如高溫，較低或較高的pH環(huán)境，以及多次凍融）仍能以一種非常穩(wěn)定的形式存在。而且，正常人和不同疾病患者血清/血漿中miRNA的表達(dá)譜，也會(huì)隨著生理狀況、疾病種類及病程的不同而發(fā)生特異性變化。血清血漿中miRNA含量普遍較低，且個(gè)體間差異較大，Agilent miRNA芯片可以使用較低的起始總RNA（miRNA）進(jìn)行試驗(yàn)，并得較為穩(wěn)定的檢出率�，F(xiàn)在，Agilent miRNA芯片已經(jīng)被較多地應(yīng)用于疾病miRNA生物標(biāo)志物的篩選。伯豪客戶也發(fā)表了一系列較高質(zhì)量的相關(guān)文章，發(fā)現(xiàn)了很多有重要意義的無創(chuàng)血清血漿miRNA標(biāo)志物。

伯豪案例選摘：

● 血漿樣本：

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院、復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所樊嘉教授領(lǐng)銜的課題組在肝癌早期診斷方面的研究取得突破。他們從不同人群血漿中篩選到了由7個(gè)miRNA組成的早期肝癌診斷分子標(biāo)記物，將其整合后建立起診斷模型，可用來成功“區(qū)分”健康人、慢性乙肝患者、乙肝肝硬化患者和肝癌患者；對(duì)小于2厘米的肝癌，檢出率更接近九成。

許多研究表明，在肝癌和癌旁正常組織之間存在miRNA表達(dá)譜的差異。另外，研究發(fā)現(xiàn)在人類血清血漿中存在大量穩(wěn)定的miRNA。這些現(xiàn)象表明，大家可以尋找肝癌患者血清血漿中高含量的miRNA，以此作為生物標(biāo)志物進(jìn)行肝癌的早期診斷。在本研究課題中，研究人員利用miRNA芯片篩選、RT-PCR驗(yàn)證等方法尋找到7個(gè)miRNA的組合，這一組合能對(duì)乙型肝癌（hepatitis B virus related HCC）患者進(jìn)行早期診斷。相關(guān)成果發(fā)表在2011年12月的《Journal of Clinical Oncology》上。miRNA生物芯片技術(shù)服務(wù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司/生物芯片上海國家工程研究中心完成。

伯豪案例：

Zhou J, Yu L, Gao X, Hu J, Wang JP, Dai Z, Wang JF, Zhang ZY, Lu SH, Huang XW, Wang Z, Qiu SJ, Wang XY, Yang GH, Sun HC, Tang ZY, Wu Y, Zhu HG, Fan J. Plasma MicroRNA Panel to Diagnose Hepatitis B Virus–Related Hepatocellular Carcinoma. J Clin Oncol. 2011.38.2697.

其他案例：

大腸癌血漿miRNA標(biāo)志物：

Wang S, Xiang J, Li Z, Lu S, Hu J, Gao X, Yu L, Wang L, Wang J, Wu Y, Chen Z, Zhu H. A plasma microRNA panel for early detection of colorectal cancer. Int J Cancer. 2013 Mar 2.

先兆子癇miRNA標(biāo)志物：

Wu L, Zhou H, Lin H, Qi J, Zhu C, Gao Z, Wang H. Circulating microRNAs are elevated in plasma from severe pre-eclamptic pregnancies. Reproduction. 2011 Dec 20.

● 血清樣本：

利用血清樣本來篩選疾病的miRNA標(biāo)志物所采用的策略與血漿樣本類似，除了在采樣時(shí)的不同處理外，后期一般都會(huì)先利用miRNA芯片先初步篩選健康人和患者之間表達(dá)有顯著差異的miRNA，然后再擴(kuò)大樣本，利用定量PCR技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，以及建立標(biāo)志物的診斷或預(yù)后模型。

伯豪案例：

鼻咽癌血清miRNA標(biāo)志物：

Liu N, Cui RX, Sun Y, Guo R, Mao YP, Tang LL, Jiang W, Liu X, Cheng YK, He QM, Cho WC, Liu LZ, Li L, Ma J. A four-miRNA signature identified from genome-wide serum miRNA profiling predicts survival in patients with nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer. 2014 Mar 15;134(6):1359-68.

胃癌血清miRNA標(biāo)志物：

Liu HS, Zhu L, Liu BY,Yang L, Meng XX, Zhang W, Ma YY, Xiao HS. Genome-wide microRNA profiles identify miR-378 as a serum biomarker for early detection of gastric cancer. Cancer Lett. 2012 Mar 28;316(2):196-203.

乙肝血清miRNA標(biāo)志物：

Zhang H, Guan Y, Lu YY, Hu YY, Huang S, Su SB. Circulating miR-583 and miR-663 Refer to ZHENG Differentiation in Chronic Hepatitis B. Evid Based Complement Alternat Med. 2013, 2013:751341.

6.唾液樣本

因?yàn)橥僖合傺\(yùn)豐富，唾液是血循環(huán)的末端產(chǎn)物，所以幾乎所有在血液中存在的分子物質(zhì)，如DNA、RNA、蛋白、藥物、病毒等也見于唾液中。唾液被喻為“人體健康的一面鏡子”，能反映機(jī)體的各種疾病狀態(tài)，如癌癥、感染性疾病和心血管疾病等在美國，利用唾液診斷藥物濫用、HIV感染、激素水平、中毒等多種商業(yè)試劑已經(jīng)被美國 FDA批準(zhǔn)上市并得以廣泛應(yīng)用。已有研究表明唾液中轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)、代謝物等分子物質(zhì)能夠檢測(cè)口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥綜合癥等口腔或其他系統(tǒng)疾病。microRNAs（miRNAs）表達(dá)失調(diào)已證明與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，miRNAs 可作為腫瘤標(biāo)志物對(duì)腫瘤具有較佳的診斷價(jià)值。而且唾液miRNAs作為分子標(biāo)志物已經(jīng)成功用于檢測(cè)口腔癌、干燥綜合癥、食管癌等疾病。

在國際癌癥研究的優(yōu)秀期刊《Cancer Prevention Research》（影響因子5.269）雜志中以論著形式發(fā)表了廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/廣東省人民醫(yī)院消化內(nèi)科牽頭的針對(duì)檢測(cè)可切除性胰腺癌生物標(biāo)志物的研究論文。論文報(bào)道了該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)兩種對(duì)切除性胰腺癌有良好診斷值的唾液microRNA。該課題組研究人員是第一次在可切除性胰腺癌病人的唾液標(biāo)本中利用Agilent 芯片技術(shù)檢測(cè)了miRNA的表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)其與健康對(duì)照人的唾液miRNAs表達(dá)譜間有明顯差異。課題相關(guān)的芯片檢測(cè)技術(shù)由上海伯豪生物技術(shù)有限公司提供。同時(shí)成功地利用qPCR技術(shù)和 logistic回歸分析，驗(yàn)證了兩種唾液miRNAs有望成為可切除性胰腺癌的分子標(biāo)志物。

唾液采集簡(jiǎn)單且無創(chuàng)，該研究為發(fā)掘良好的胰腺癌無創(chuàng)傷性篩查工具提供了新的參考依據(jù)，并為利用唾液miRNAs作為分子標(biāo)志物診斷系統(tǒng)性疾病開辟了新的前景和提供了新的思路。

伯豪案例：
Xie Z, Yin X, Gong B, Nie W, Wu B, Zhang X, Huang J, Zhang P, Zhou Z, Li Z.Salivary microRNAs show potential as a noninvasive biomarker for detecting resectable pancreatic cancer. Cancer Prev Res (Phila). 2015 Feb;8(2):165-73.

7.尿液樣本

除了血清血漿及唾液等樣本外，其他體液也被用于尋找無創(chuàng)生物標(biāo)志物。泌尿系統(tǒng)疾病患者如果在泌尿系統(tǒng)器官中出現(xiàn)損傷，那么血液中或者腎單位細(xì)胞身所特異表達(dá)的一些miRNA就有可能出現(xiàn)在尿液中。和血液一樣，尿液樣本易于采集，穩(wěn)定度高，不易被降解，重復(fù)性及特異性高，使得其有可能成為臨床診斷的敏感指標(biāo)。不同泌尿系統(tǒng)的診斷及治療方案不同，因此在臨床上如果可以及早明確疾病類型，就更有利于患者的治療和預(yù)后。

比如Zhang et al.（2014）就利用Agilent miRNA芯片發(fā)現(xiàn)尿液中特異表達(dá)的MicroRNA-99a 和MicroRNA-125b可以作為膀胱癌的診斷標(biāo)志物。

原文出處：Zhang DZ, Lau KM, Chan ES, Wang G, Szeto CC, Wong K, Choy RK, Ng CF. Cell-free urinary microRNA-99a and microRNA-125b are diagnostic markers for the non-invasive screening of bladder cancer. PLoS One. 2014 Jul 11;9(7):e100793.

8..其他

其他體液如腦脊液（cerebrospinal fluid），支氣管灌洗液（bronchial lavage fluid），甚至糞便等等也可以作為實(shí)驗(yàn)樣本用于miRNA標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)。

來源：上海伯豪生物技術(shù)有限公司
聯(lián)系電話：021-58955370
E-mail：market@shbio.com

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