酵母菌的鑒定

微生物學(xué)的類別分門、綱、目、科、屬、種，生產(chǎn)酒精用酵母菌屬于微生物中的真菌門、子囊菌綱、原子囊菌亞綱、內(nèi)孢霉目、內(nèi)孢霉科、啤酒酵母屬、卡爾斯伯酵母屬等。

(一)形態(tài)特征的鑒定

把酵母菌接種到麥芽汁固體培養(yǎng)基上，讓它長(zhǎng)成菌落，觀察其菌落的形態(tài)、顏色、質(zhì)地、邊緣、表面等特征。把它再接種到液體麥芽汁培養(yǎng)基中，觀察是否能產(chǎn)生醭、試管或培養(yǎng)儀器表面壁上能否形成菌環(huán)，培養(yǎng)液中是否產(chǎn)生沉淀、混濁程度等。另外，還要取樣在顯微鏡下觀察其單細(xì)胞的形態(tài)、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。

(二)生理生化特征的鑒定

酵母菌的生理生化特征主要表現(xiàn)為發(fā)酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖等糖類的能力。同時(shí)，還需測(cè)定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸鹽還是硫酸鹽，發(fā)酵產(chǎn)酸、產(chǎn)醋、耐溫、耐酸、抗重金屬離子、抗雜菌性等的能力。

一、酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)

酵母菌在厭氧條件下能分解糖類，產(chǎn)生各種有機(jī)酸、氣體和其它產(chǎn)物。酵母菌種類不同對(duì)各種糖類的發(fā)酵能力各異。因此，這是鑒別酵母菌種類的一項(xiàng)重要依據(jù)。

酸的產(chǎn)生可根據(jù)培養(yǎng)基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫變黃）或溴麝香草酚藍(lán)（pH7.6-6.0由藍(lán)變黃）指標(biāo)劑顏色的改變來(lái)確定。產(chǎn)氣可由發(fā)酵管氣泡的產(chǎn)生予以證實(shí)。

二、酵母菌碳源同化試驗(yàn)

碳是酵母菌細(xì)胞的重要組成成分，約占酵母菌體重量的50%，為酵母菌生命活動(dòng)提供所需的能量和組成其結(jié)構(gòu)的物質(zhì)。酵母菌對(duì)各種碳源的利用，因種類不同而異。這是酵母菌分類鑒定的一個(gè)重要依據(jù)。

三、酵母菌氮源同化試驗(yàn)

酵母菌蛋白酶不分泌于菌體外，故酵母菌對(duì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)不能利用，酵母菌對(duì)一些較簡(jiǎn)單的含氮化合物的利用程度也不一致。

四、酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定試驗(yàn)

酵母菌屬于單細(xì)胞真核型微生物，把一定數(shù)量的酵母菌接種于的液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)時(shí)，它的生長(zhǎng)過程具有一定的規(guī)律性。在其生長(zhǎng)過程中，定時(shí)取樣測(cè)定酵母菌細(xì)胞數(shù)量，然后以酵母菌細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，繪制所得的曲線叫生長(zhǎng)曲線。此生長(zhǎng)曲線大致可劃分為四個(gè)階段：調(diào)整期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰退期。 

 

1. 酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)
糖發(fā)酵基礎(chǔ)液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。 

2. 酵母菌碳源同化試驗(yàn) 

1. 酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)
糖發(fā)酵基礎(chǔ)液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麥芽糖，啤酒酵母斜面菌種。

2. 酵母菌碳源同化試驗(yàn)   

無(wú)碳基礎(chǔ)培養(yǎng)基，啤酒酵母斜面菌種，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麥芽糖溶液。

一、酵母菌糖發(fā)酵試驗(yàn)

1)   糖發(fā)酵基礎(chǔ)液配制好后，按培養(yǎng)液容量的1%加入糖，分裝于杜氏發(fā)酵管中（培養(yǎng)液的高度約為4-5厘米），再在試管內(nèi)加入倒置的小玻管（約0.4×2.0－2.5厘米）一支。每種糖設(shè)三個(gè)重復(fù)管，<121℃>高壓滅菌15分鐘。

2)   將酵母分別接入上述各發(fā)酵管中，置<30℃>下培養(yǎng)48-72小時(shí)，另以不接種者作對(duì)照

3)   如產(chǎn)酸則培養(yǎng)液pH值下降而變黃色；如產(chǎn)氣，則必先產(chǎn)酸，并在杜氏小管頂端出現(xiàn)氣泡。

4)   結(jié)果記錄。以“ ”表示產(chǎn)酸，“<0”>表示產(chǎn)氣，“＋”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“－”表示無(wú)變化，“堿”表示產(chǎn)堿。 

二、酵母菌碳源同化試驗(yàn)

生長(zhǎng)圖譜法

1)   無(wú)碳培養(yǎng)基內(nèi)加入2%的水洗瓊脂，融化后冷卻至45<-50℃>，到至平板。

2)   接種新鮮培養(yǎng)的啤酒酵母于1毫升無(wú)菌生理鹽水內(nèi)，攪勻后倒入上述未凝平板內(nèi)，搖勻待凝。

3)   皿底用特種蠟筆寫上被測(cè)試各種碳源的標(biāo)記。

4)   用不銹鋼匙，按標(biāo)記加入相應(yīng)的米粒大小的碳源，并以葡萄糖作對(duì)照。

5)   <28℃>下培養(yǎng)24-48小時(shí)后觀察結(jié)果。

三、酵母菌氮源同化試驗(yàn)  

1、液體試管法

 

方法同二，以被測(cè)試的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白對(duì)照。

 

2、生長(zhǎng)圖譜法

 

方法同二，以被測(cè)試的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白對(duì)照。

 

3、結(jié)果觀察

 

1）液體試管中溶液pH值的變化。

 

2）生長(zhǎng)圖譜中測(cè)量形成菌落的大小，說明對(duì)各種氮源的利用情況。

四、酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定試驗(yàn) 

1、將培養(yǎng)24小時(shí)左右的酵母斜面菌種，用無(wú)菌水洗下菌苔，以3000轉(zhuǎn)/分的速率離心，得菌體。將酵母菌體沉淀物再用無(wú)菌水洗2-3次后，制備酵母菌懸液（細(xì)胞數(shù)量約106左右/毫升），測(cè)數(shù)備用。

 

2、取上述菌懸液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培養(yǎng)液的試管中，<25℃>下培養(yǎng)，以此為起始時(shí)間，記錄起始溶液的細(xì)胞數(shù)。并在培養(yǎng)1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小時(shí)時(shí)分別取樣檢測(cè)酵母菌細(xì)胞數(shù)量。

3、酵母菌細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)

 

方法①：活菌計(jì)數(shù)法。此法是將以上定時(shí)取出的被檢樣品作一系列稀釋后，取一定量體積（在0.1-1毫升之間）的稀釋液涂布于盛有固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，在<25℃>下培養(yǎng)24小時(shí)左右，計(jì)算培養(yǎng)皿內(nèi)菌落數(shù)就可測(cè)出溶液中活菌數(shù)量。

 

方法②：血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。此法是先將以上定時(shí)取出的被檢樣品作一系列稀釋后，使菌落數(shù)約為105-106個(gè)/毫升，取一滴稀釋液滴于血球計(jì)數(shù)板內(nèi)，在顯微鏡下直接計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。

 

4、繪制生長(zhǎng)曲線

 以酵母菌細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)作為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，畫出酵母菌的生長(zhǎng)曲線。并分析酵母菌群體的生長(zhǎng)規(guī)律。

 

附表1 酵母菌分屬鑒定結(jié)果

菌株

形態(tài)特征

生理特征

糖發(fā)酵

糖同化

菌落

瞨膜

細(xì)胞形態(tài)大小

無(wú)性繁殖方式

假菌絲

子囊孢子

葡萄糖

乳糖

半乳糖

麥芽糖

蜜二糖

蔗糖

棉子糖

葡萄糖

乳糖

半乳糖

麥芽糖

蔗糖

纖維二糖

蜜二糖

海藻糖

L阿拉伯糖

D阿拉伯糖

棉子糖

D木糖

可溶性淀粉

山梨糖

菌株

氮源同化

醇類同化

在無(wú)維生素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)

其他

維生素需要

硝酸鉀

硫酸銨

乙醇

甘油

山梨醇

衛(wèi)矛醇

赤蘚醇

阿東醇

肌醇

甘露醇

牛奶反應(yīng)

油脂分解

抗放線菌酮

產(chǎn)生類淀粉

于37℃生長(zhǎng)

耐高滲透壓

生物素

微生素B1

微生素B2

微生素B6

微生素B12

葉酸

煙酸

泛酸鈣

對(duì)氨基苯甲酸

附1麥芽汁培養(yǎng)基的制備：

麥芽汁制備俗稱糖化。所謂糖化是指將麥芽和輔料中高分子貯藏物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、淀粉、半纖維素等機(jī)器分解中間產(chǎn)物）通過麥芽中各種水解酶類（或外加酶制劑）作用降解為低分子物質(zhì)并溶于水的過程。溶解于水的各種干物質(zhì)稱為浸出物，糖化后未經(jīng)過濾的料液稱為糖化醪，過濾后的清夜稱為麥芽汁，麥芽汁中浸出物含量和原料干物質(zhì)之比（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）稱為無(wú)水浸出率。

方法一

（1）取50g麥芽，在EBC標(biāo)準(zhǔn)磨上粉碎；

（2）將已經(jīng)粉碎好的麥芽粉放入已稱重的糖化杯中，加200mL46℃水，不斷攪拌并在46℃水浴中保溫30min；

（3）使醪液以1℃/ min速率升溫到70℃。此時(shí)杯內(nèi)加入100mL70℃水，保持恒溫。

（4）5min后用玻璃棒取麥芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后觀察碘液顏色變化。直到碘液呈純黃色不再變色，停止保溫，糖化結(jié)束。

（5）在10~15min內(nèi)急劇冷卻到室溫；

（6）沖洗攪玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其內(nèi)容物準(zhǔn)確稱量為450g；

（7）用玻璃棒攪拌糖化杯，并注于漏斗中進(jìn)行過濾，即獲得麥芽汁。

方法二

稱取市售麥芽粉或大麥經(jīng)浸泡、發(fā)芽、干燥、粉碎的麥芽粉，按每Kg麥芽粉加入60—65℃溫?zé)崴?.5—4kg。于55—60℃保溫糖化3-4小時(shí)，用碘液檢查，然后4層紗布過濾，過濾液中加雞蛋白加水20 mL，調(diào)勻之生出豐富的泡沫為止，然后倒在糖化液中攪拌煮沸后用4層紗布過濾，即得到澄清、透明的麥芽汁，滅菌后方可備用。

 

附2  酵母菌鑒定常用培養(yǎng)基

1.酵母菌生孢培養(yǎng)基

（1）麥?zhǔn)檄傊?/DIV>