多通道氣液界面細胞直接暴露染毒技術(shù)-CultexRFS Compact

一種在氣-液界面，空氣與細胞直接接觸的實驗方法，由Cultex公司Aufderheide教授提出。細胞頂部表面直接暴露于一個恒流的大氣環(huán)境中，底部有培養(yǎng)基供給，并有恒定溫度及CO₂環(huán)境。2009年，Cultex公司提出了經(jīng)典的輻射流氣道設(shè)計（Radial Flow System -Cultex^® RFS)，Cultex RFS被譽為細胞體外暴露方法中最成功的技術(shù)。

2014年，Cultex公司推出第三代細胞暴露染毒系統(tǒng)Cultex RFS Compact，細胞氣液界面的直接暴露。在RFS技術(shù)基礎(chǔ)上，compact增加了細胞培養(yǎng)暴露腔室數(shù)量，共計6個cell culture inserts，并分為兩組，可對其中一組（三個cell culture inserts）進行霧霾顆粒物暴露，另一組進行清潔空氣暴露的對比實驗，或6個腔室全部進行受試物/潔凈空氣的暴露實驗。

系統(tǒng)內(nèi)6腔室徑向分布，保證顆粒物均勻的分布到每個腔室。電加熱系統(tǒng)為細胞體外培養(yǎng)提供最佳溫度條件，專門的CO₂接入單元保證細胞進行更長時間的體外暴露。系統(tǒng)集成到一個帶有緊鎖裝置的支架中，保證系統(tǒng)的氣密性。Cultex RFS Compact經(jīng)過Cultex實驗室對不同受試物質(zhì)氣溶膠的劑量反應(yīng)（dose-response），及不同暴露時間對受試物質(zhì)細胞毒性的劑量依賴（dose-dependent）進行實驗驗證，驗證實驗表明其具有高度的實驗重復(fù)性及可靠性。

材料和方法

1、  Cultex RFS Compact

2、  6.5mm或12mm的細胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）

3、  Bronkhorst高精度MFC

4、  培養(yǎng)基灌注系統(tǒng)

5、  細胞株（ATCC：ccl-185）和分離的原代正常人支氣管上皮細胞（NHBE）

       

圖 1: 兩種氣路分布的CULTEX® RFS Compact

左圖: 三個細胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）暴露于受試氣溶膠，另外三個平行暴露于潔凈空氣

右圖: 六個細胞培養(yǎng)小室（cell culture inserts）全部暴露于受試氣溶膠或潔凈空氣

顆粒物暴露實驗在Cultex® RFS Compact中進行，細胞接種于12孔細胞培養(yǎng)小室中（well cell culture insert，COSTAR®/Corning），在氣-液界面直接接觸暴露顆粒物24小時。在實   驗過程中，細胞底部持續(xù)供給培養(yǎng)基，并通過電加熱系統(tǒng)保證環(huán)境穩(wěn)定在37°C。

香煙煙霧（全煙氣/氣相-K3r4F）和1.6%尼古丁液（電子煙）作為受試物質(zhì)進行細胞暴露實驗。

用WST-1法測定細胞活性。對于電子香煙的細胞暴露，同時分析細胞氧化應(yīng)激水平。暴露24后進行結(jié)果分析。結(jié)果與清潔空氣控制組進行對比（圖2和圖3）。兩組之間存在顯著差異，而符號（星號）定義如下：

**** p < 0.0001非常顯著,            *** p = 0.0001 – 0.001 非常顯著,

**  p = 0.001 – 0.01 很顯著,          * p = 0.01 – 0.05 顯著

圖2: 采用WST-1分析法分析香煙煙氣（全煙氣/氣相）對A549細胞的細胞毒性作用。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對比清潔空氣，10支香煙主流煙氣降低A549細胞的活性。隨著更多數(shù)量煙氣的暴露，細胞活性逐漸減小，同時全煙對細胞活性的影響更加明顯，相比煙氣相。暴露在清潔空氣中的細胞與細胞孵化箱中細胞的活性未有明顯變化。

圖3: 香煙煙霧和1.6%尼古丁液（電子煙）對NHBE暴露后的細胞毒性作用和氧化應(yīng)激反應(yīng)。結(jié)果與潔凈空氣控制組的對比。Data are given as means + S.D. from 3 independent experiments with 3 samples each.

對NHBE細胞，細胞活力和氧化應(yīng)激水平的影響是相對的。暴露于電子煙液的細胞，細胞活性降低并氧化應(yīng)激水平的增加。主流煙氣的暴露，細胞的更低存活率和更高的氧化應(yīng)激。清潔空氣控制組的細胞比孵化器內(nèi)培養(yǎng)的細胞表現(xiàn)出較高的氧化應(yīng)激，這是由于清潔空氣氣流對細胞的機械剪切力刺激的結(jié)果。所以，孵化器和清潔空氣控制的細胞存活率差異不顯著。

•  CULTEX® RFS Compact適用于6個 6.5 mm 或 12 mm 現(xiàn)有的通用細胞培養(yǎng)小室（COSTAR®和 Falcon®）的直接暴露。

•  每個CULTEX® RFS Compact 內(nèi)可進行兩組平行實驗，三個培養(yǎng)小室（cell culture inserts）用于受試物，另外三個平行用于清潔空氣或不同濃度受試物。

•  數(shù)據(jù)顯示其具有良好的劑量效應(yīng)和高度的實驗重復(fù)性。

•  適用于氣體為載體的各種受試物質(zhì)，如香煙煙霧、納米顆粒、PM2.5、PM10、VOCs、霧霾混合物、干粉顆粒物及霧化氣溶膠等等。