比率檢測氯化鋇誘導(dǎo)的大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞上內(nèi)向整流鉀通道（Kir）的變化

FLIPR^TETRA和電壓敏感探針：比率檢測氯化鋇誘導(dǎo)的大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞上內(nèi)向整流鉀通道（Kir）的變化。離子通道和轉(zhuǎn)運體是位于細(xì)胞膜上調(diào)控離子穿過生物膜的蛋白質(zhì)。對這些蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)引起了心律失常、高血壓和神經(jīng)紊亂等疾病的藥物治療開發(fā)。同時，這些蛋白質(zhì)也是藥物不良反應(yīng)潛在的作用位點。高通量篩選方法在使用最小量化合物產(chǎn)生有用數(shù)據(jù)方面具有高效率和成本效益好等特點。FLIPR^TETRA® 系統(tǒng)配置了390–420nm波長激發(fā)光LED以及440–480nm和565–625nm波長的濾光片，使用電壓敏感探針(Voltage Sensor Probe, VSP)染料用于基于FRET原理的高通量篩選（HTS）實驗，提供了一種新型的細(xì)胞基礎(chǔ)的膜電位變化檢測方法。在本實驗中，包含了一種內(nèi)向整流鉀通道（Kir）的大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞——RBL-2H3被誘導(dǎo)引起了細(xì)胞膜電位變化。氯化鉀被用來引起細(xì)胞膜去極化，而氯化鋇被用于阻斷這個去極化反應(yīng)。比率化分析對FRET數(shù)據(jù)進行了背景校正和直接對比。本篇應(yīng)用文章展示了FLIPR^TETRA系統(tǒng)結(jié)合VSP染料所帶來的靈敏和高效的離子通道與轉(zhuǎn)運體引起的細(xì)胞膜電位變化的檢測實驗。

 

 

電壓敏感探針是一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer ，F(xiàn)RET)原理的用于高通量離子通道藥物研發(fā)的實驗技術(shù)。FRET供體--香豆素-磷脂(coumarin-phospholipid，CC2-DMPE)只結(jié)合在細(xì)胞膜外側(cè)。FRET受體是可移動的、帶負(fù)電荷的疏水性類菁染料化合物染料(oxonol)[DiSBAC2(3)或DiSBAC4(3)]，根據(jù)膜電位變化結(jié)合在細(xì)胞膜的一側(cè)。靜息細(xì)胞膜電位是負(fù)的。因而，兩個探針都結(jié)合在細(xì)胞膜的外側(cè)，實現(xiàn)有效的FRET效應(yīng)。390–420nm波長LED 激發(fā)CC2-DMPE供體探針，從oxonol受體探針處產(chǎn)生580nm波長強的紅色熒光信號。當(dāng)細(xì)胞膜電位變正后，例如KCl引起的細(xì)胞去極化，oxonol受體探針快速的改變位置至膜的另一側(cè)。因此，每個oxonol受體探針對細(xì)胞電位變化“感受“并反應(yīng)。這種轉(zhuǎn)移位置打破了FRET效應(yīng)，CC2-DMPE供體探針激發(fā)后在460nm波長產(chǎn)生了強的藍(lán)色熒光信號。

 

RBL-2H3：含有內(nèi)向整流鉀通道(Kir)的大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞 (ATCC Cat. #CRL-2256)

培養(yǎng)基：Eagle’s Minimum Essential Media (ATCC Cat. #30-2003), 10% FBS (Hyclone Catalog Cat. #SH-30071)

不含鈣、鎂的PBS (Invitrogen Cat. #14190-144) Trypsin/EDTA (0.05% Trypsin/1mM EDTA) (Invitrogen Cat. #25300-054)

VSP溶液-1：160 mM NaCl (Sigma Cat. #S-5886), 4.5 mM KCl, (Sigma Cat. #P5405), 2 mM CaCl2 (Sigma Cat. #C-7902), 1 mM MgCl2 (Sigma Cat. #M-4880), 10 mM glucose (Sigma Cat. #G-7021), 10 mM HEPES (Invitrogen Cat. #15630-080), pH 7.4

高鉀溶液：164 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7.4

無菌水 (Irvine Scientific Cat. #9309)

DMSO (Dimethyl Sulfoxide, Aldrich Cat. #47,230-1)

氯化鋇 (Sigma Cat. #B-0750)

Pluronic F127 (Invitrogen Cat. #P3000)

電壓敏感探針試劑盒：DisBac2(3)和CC2-DMPE (Invitrogen Cat. #K1016), VABSC-1 背景抑制染料 (Invitrogen Cat. #K1019)

FLIPR^TETRA 高通量熒光檢測分析系統(tǒng)(Molecular Devices)

 

細(xì)胞準(zhǔn)備

用胰酶消化預(yù)先培養(yǎng)的RBL-2H3細(xì)胞，實驗前18-24小時清洗并種植在BD BioCoat™多聚賴氨酸包被的384孔板 (Cat. #356663, BD Biosciences)中，每孔12,500個細(xì)胞。細(xì)胞在37°C和5% CO2條件下過夜培養(yǎng)。實驗開始當(dāng)天母液、染料和緩沖液可室溫放置。VSP加載緩沖液和氯化鋇濃度梯度化合物在VSP-1緩沖液中配制。

準(zhǔn)備VSP加載緩沖液

CC2-DMPE緩沖液：

Step 1 準(zhǔn)備5mM DMSO母液并分裝保存至-20°C。

Step 2 實驗開始當(dāng)天，準(zhǔn)備一份工作溶液。CC2-DMPE母液和同體積的10% Pluronic Acid混合并隨后用VSP-1溶液稀釋至5μM。

Step 3 緩沖液在使用前充分混合并避光。

DiSBAC2(3)緩沖液：

Step 1 準(zhǔn)備12mM DiSBAC2(3)的DMSO母液并保存至 -20°C.

Step 2 準(zhǔn)備200mM VABSC-1的水質(zhì)母液并在室溫下避光保存。更多說明參考Invitrogen VSP 產(chǎn)品手冊

Step 3 實驗開始當(dāng)天，用VSP-1溶液準(zhǔn)備4μM DiSBAC2(3)的工作溶液，其中含有0.2μM VABSC-1 淬滅劑。在FLIPRTETRA系統(tǒng)中進行VSP染料實驗除安裝相應(yīng)的LED和濾光片之外沒有其它特別要求。

細(xì)胞中加載染料

Step 1 去除384孔板中所有孔的培養(yǎng)基，并加入50μL VSP-1溶液代替。

Step 2 立即去除VSP-1溶液并加入25μL的CC2-DMPE加載緩沖液。

Step 3 室溫下細(xì)胞板覆蓋避光孵育30分鐘。

Step 4 30分鐘后去除CC2-DMPE加載緩沖液并加入50μL的VSP-1溶液。

Step 5 立即去除VSP-1并加入25μL的4μM DiSBAC2(3)和0.21 μM VABSC-1加載緩沖液。

Step 6 加入10X 濃度的BaCl2 化合物(離子通道抑制劑)至相應(yīng)的孔中

Step 7 室溫下細(xì)胞板避光孵育30分鐘。更多詳細(xì)信息參考Invitrogen VSP使用指南。

 

FLIPR^TETRA 系統(tǒng)配置和校正

FLIPRTETRA 系統(tǒng)的操作軟件ScreenWorks.具有非常友好的用戶界面，便于進行實驗方案的編輯和參數(shù)設(shè)置。更多信息可參考FLIPRTETRA 用戶指南。系統(tǒng)自帶一個黃色檢測板可用于校正390–420nm激發(fā)光源LED和565–625nm發(fā)射光濾片。 含有7-二乙胺香豆素-3-羧酸的檢測板被用于校正390–420nm激發(fā)光源LED和440–480nm發(fā)射光濾片，具體步驟見下。

390–420 nm激發(fā)光源LED和440–480 nm 濾光片 校正板制備

Step 1 配制0.02M的7-二乙胺香豆素-3-羧酸DMSO母液（Molecular Probes Cat. #D-1421）。

置于離心管中渦旋混合。

Step 2 分裝成小份并保存于-20°C。

Step 3 在校正的1小時內(nèi)，溶解一份第二步母液并在同樣的用于染料加載的緩沖液中稀釋成20–30 mL 10-5 M溶液。調(diào)節(jié)pH值至7.4，渦旋混合。

Step 4 每孔加入分裝的香豆素溶液25μL（384孔板）或100μL（96孔板）。

 

在FLIPRTETRA系統(tǒng)中運行VSP實驗

實驗溶液體積、加樣高度和速度等參數(shù)取決具體具體實驗和細(xì)胞類型的要求來進行優(yōu)化，以避免吹動孔底的細(xì)胞。

表1是推薦的RBL-2H3細(xì)胞實驗機器參數(shù)設(shè)置，以供參考。

 

 

在FLIPR^TETRA系統(tǒng)中，加入25μL高K+去極化溶液前440–480nm和565–625nm的信號依次被記錄10秒并在加樣后40秒再次被記錄10秒。實驗中這兩個時間點平均的信號記錄構(gòu)成了比率分析的基礎(chǔ)。

 

比率數(shù)據(jù)計算

比率數(shù)據(jù)分析提供了背景校正和FRET的440–480nm和565–625nm數(shù)據(jù)的直接對比。同一細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果可以在極化和非極化狀態(tài)下進行對比。圖2所示是來自FLIPR^TETRA系統(tǒng)的一組數(shù)據(jù)示例。

 

 

在相同的數(shù)據(jù)窗口中，檢測了加樣前和加樣后40-60秒的平均信號值。不含細(xì)胞的記錄孔中平均信號值在統(tǒng)計時作為基線校準(zhǔn)值（baseline corrected values，BLC）被去除。每一個孔中都通過加入去極化效應(yīng)試劑后的RFU值除以初始RFU值來計算反應(yīng)背景校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)比率值（R / Ro）。

去極化和極化狀態(tài)下的發(fā)射光比率：

Emission RatioPolarized = BLC 440–480initial/BLC 565–625initial

Emission RatioDepolarized = BLC 440–480final/BLC 565–625final

The response ratio is calculated as:

R/Ro= Emission RatioDepolarized/Emission RatioPolarized

 

使用FLIPRTETRA 系統(tǒng)進行檢測發(fā)現(xiàn)氯化鋇抑制大鼠嗜堿性白血病細(xì)胞上Kir的IC50是270μM。 這個結(jié)果是用過在Graphpad Prism®軟件上采用4參數(shù)曲線計算得到的。傳統(tǒng)膜片鉗得到的數(shù)據(jù)結(jié)果2的IC50是500μM。作為對FLIPRTETRA 系統(tǒng)進行的實驗的整體表現(xiàn)的評價，在IC80水平下計算的Z因子是0.58。Z因子是一個比較和評估實驗質(zhì)量并用來優(yōu)化實驗的工具。3 Z因子 > 0.5時被認(rèn)為是一個有效的實驗。

 

 

 

FLIPRTETRA系統(tǒng)配置了390–420nm激發(fā)光源LED和440–480nm及565–625nm濾光片，有效地進行了比率檢測的電壓敏感探針實驗。IC50結(jié)果與傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)的結(jié)果是一致的。比率法染料的實驗和FLIPRTETRA系統(tǒng)，連同其它膜電位試劑一起，是重要的離子通道功能檢測和實驗研究的工具。多種用戶可自行更換的LED模塊和濾光片結(jié)合比率法染料以及實時記錄的96孔和384孔記錄模式提供了非常靈活多樣的離子通道和轉(zhuǎn)運體引起的膜電位改變的檢測。

 

1. M. Falconer, et al. High-throughput screening for ion channel modulators.

J Biomol Screen Volume 7, (5)460–465 (2002).

2. J. Gonzalez, et al. Cell-based assays and instrumentation for screening ion- channel targets. Drug Discovery Today 4(9): 431–439 (1999).

3. J. Zhang, et al. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. J Biomol Screen Vol. 4, (2)60–73 (1999).