單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞篩選技術(shù)

 

1986年，美國FDA批準(zhǔn)了第一個(gè)單克隆抗體藥物上市，距今已快30年。目前，全世界共有超過40個(gè)治療用抗體藥物被批準(zhǔn)上市，每年實(shí)現(xiàn)超過600億美元的銷售額。在國際及國內(nèi)形成了抗體藥物開發(fā)熱潮。巨大的市場前景和現(xiàn)存的技術(shù)問題及壁壘并存的現(xiàn)實(shí)不可避免地引發(fā)抗體藥物新一輪技術(shù)革命。而其結(jié)果又將毫無疑問地改變抗體藥物的市場格局。

但是，抗體不管是作為檢測試劑，還是作為具有巨大市場前景的治療藥物。首先，我們都需要通過篩選找到單克隆抗體。傳統(tǒng)的單克隆抗體制備方法主要是雜交瘤技術(shù)。這是目前比較成熟，技術(shù)難度比較低，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室仍然在使用的方法。

在單克隆抗體制備過程中，有兩次篩選過程，第一次是使用選擇性培養(yǎng)基選出雜交瘤細(xì)胞；第二次就是進(jìn)一步選出能產(chǎn)生我們需要的抗原特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞。

利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的基本原理是根據(jù)以下三個(gè)原則：

1、一種淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種抗體；

2、細(xì)胞融合技術(shù)產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持雙方親代細(xì)胞的特性；

3、利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選出雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆化，然后大量培養(yǎng)增殖， 制備所需的單克隆抗體。

第一次篩選的原理和方法：

細(xì)胞融合后，雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵。普遍采用的HAT選擇性培養(yǎng)液是在普通的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷酸。其依據(jù)是細(xì)胞中DNA的合成有兩條途徑：

一條途徑是生物合成途徑(D途徑)，即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，為DNA分子的合成提供原料。在此合成過程中，葉酸作為重要的輔酶參與這一過程，而HAT培養(yǎng)液中氨基蝶呤是一種葉酸的拮抗劑，可以阻斷DNA合成的“D途徑”。

另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑(S途徑)，它是利用次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸，兩種酶缺一不可。

因此，在HAT培養(yǎng)液中，未融合的B細(xì)胞及兩個(gè)B細(xì)胞的融合產(chǎn)物的D途徑被氨基蝶呤阻斷，雖S途徑正常，但因缺乏在體外培養(yǎng)液中的增殖能力，一般在10天左右會(huì)死亡。對(duì)于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言，由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)缺陷細(xì)胞，因此自身沒有S途徑，且D途徑又被氨基蝶呤阻斷，所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡。只有骨髓瘤細(xì)胞與B細(xì)胞相互融合的雜交瘤細(xì)胞，既具有B細(xì)胞的S途徑，又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來，并不斷增殖。

第二次篩選的原理和方法：

在單克隆抗體的生產(chǎn)過程中，由于B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的，經(jīng)HAT培養(yǎng)液第一次篩選出的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗體存在多樣性，必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞群進(jìn)行第二次篩選，才能選出針對(duì)目標(biāo)抗原具有特異性的雜交瘤細(xì)胞。二次篩選通常采用有限稀釋法，將雜交瘤細(xì)胞多陪稀釋，接種在多孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，使每孔不超過一個(gè)細(xì)胞，通過培養(yǎng)讓其增值。然后檢測各孔上清液中細(xì)胞分泌的抗體的特異性(常用ELISA方法)，上清液可與特定抗原結(jié)合的培養(yǎng)孔為陽性孔。陽性孔中細(xì)胞還不能保證是來自單個(gè)細(xì)胞，需要繼續(xù)進(jìn)行有限稀釋，一般重復(fù)3-4次，直至確信每個(gè)孔中增值的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。第二次篩選也是鑒定特異性親和力的過程。

有限稀釋法對(duì)于篩選雜交瘤來說，是最普通的方法，在許多實(shí)驗(yàn)室中都在使用。但是，作為相對(duì)舊的技術(shù)，已經(jīng)不能滿足當(dāng)今的需求。方法自身具有許多缺點(diǎn)：

1、人工操作，操作及重復(fù)的步驟太多，不可避免容易出錯(cuò)。

2、速度慢，效率低。只能保證30-40%的孔有細(xì)胞生長。對(duì)于高通量篩選來說，不能滿足要求。

3、不能保證單克隆，需要亞克隆3-4次，所以，人工和耗時(shí)都較多。

4、有限稀釋在ELISA檢測前，并不知道哪一個(gè)克隆滿足抗原特異性的要求。所以，需要對(duì)所有克隆，都要最少做一次ELISA鑒定。

 

除了有限稀釋方法，現(xiàn)在相對(duì)先進(jìn)的細(xì)胞分選技術(shù)也得到普遍應(yīng)用。一般就是細(xì)胞分選儀或者流失細(xì)胞技術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選。其原理是先將細(xì)胞分散開，沒有細(xì)胞結(jié)團(tuán)。通過在細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記熒光信號(hào)。當(dāng)單個(gè)細(xì)胞在壓力作用下單個(gè)通過玻璃毛細(xì)管的時(shí)候，儀器可以自動(dòng)檢測單個(gè)細(xì)胞的熒光信號(hào)強(qiáng)度。熒光信號(hào)強(qiáng)度反應(yīng)這個(gè)細(xì)胞的相應(yīng)抗體表達(dá)水平。最后，將高熒光信號(hào)強(qiáng)度的細(xì)胞收集，再通過有限稀釋得到高水平表達(dá)的單克隆；或者也可以使用單細(xì)胞收集器收集高水平表達(dá)的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞。

 

細(xì)胞分選或者流失細(xì)胞技術(shù)的篩選原理如下圖所示：

 

 

這種技術(shù)也在很多實(shí)驗(yàn)室中使用，但是根據(jù)其篩選原理，有一些不可避免的缺陷。

1、由于必須要對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部使用熒光標(biāo)記，所以，一般主要使用于胞內(nèi)表達(dá)的蛋白或者膜表達(dá)蛋白。對(duì)于分泌表達(dá)的雜交瘤細(xì)胞來說，使用具有局限性。

2、具體檢測的是單個(gè)細(xì)胞在某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。所以，檢測結(jié)果容易受細(xì)胞周期的影響。而且，單個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平也不能很好反應(yīng)后期生產(chǎn)階段細(xì)胞群體的表達(dá)水平。

3、流失篩選技術(shù)只是對(duì)熒光信號(hào)強(qiáng)的所有細(xì)胞作出劃分，后期需要復(fù)篩的細(xì)胞數(shù)目仍然很多，下游工作量仍然比較大。

4、由于對(duì)單個(gè)細(xì)胞使用壓力操作，剪切力會(huì)降低細(xì)胞存活率。所以，低成活率也成為這個(gè)技術(shù)的一個(gè)主要缺陷。

5、流失篩選需要對(duì)管路系統(tǒng)充分清洗消毒才能確保細(xì)胞不會(huì)污染，污染的風(fēng)險(xiǎn)較高。

隨著技術(shù)進(jìn)步，我們也迫切需要一種更先進(jìn)的篩選技術(shù)。能夠滿足高通量，自動(dòng)化，高效率的要求�，F(xiàn)在，一種新的雜交瘤篩選技術(shù)平臺(tái)Clonepix2技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，并且在世界范圍內(nèi)得到廣泛使用，實(shí)踐證明其能夠大大加快雜交瘤篩選速度，并且提高效價(jià)，降低成本。其篩選原理如下：

1、 使用半固體培養(yǎng)的方法，使細(xì)胞在培養(yǎng)基上生長成單個(gè)獨(dú)立分散的單克��；半固體培養(yǎng)基可以阻止克隆移動(dòng)，保證篩選到的克隆是單克隆。

 

 

2、 在半固體培養(yǎng)基中加入熒光標(biāo)記克隆檢測試劑。克隆檢測試劑、營養(yǎng)因子以及克隆表達(dá)的蛋白分子都可以自由在半固體培養(yǎng)基中擴(kuò)散。當(dāng)熒光標(biāo)記檢測試劑捕獲目標(biāo)蛋白分子后，形成分子復(fù)合體。復(fù)合體大分子聚集在克隆的周圍。而且，隨著克隆生長時(shí)間延長，聚集更多熒光蛋白復(fù)合體。

 

 

 

3、 軟件在白光下識(shí)別細(xì)胞克隆，在熒光下對(duì)克隆的熒光水平進(jìn)行定量。并且，機(jī)械臂及挑頭可以自動(dòng)化挑取熒光水平高的細(xì)胞克隆到96孔微孔板。

 

 

 

最為最新一代技術(shù)，Clonepix2技術(shù)在篩選雜交瘤方面具有許多優(yōu)點(diǎn)：

1、第一次將克隆的篩選自動(dòng)化，可以更少時(shí)間，篩選更多克隆。

2、篩選雜交瘤效率高。由于篩選過程以及挑克隆的自動(dòng)化，可以在短時(shí)間內(nèi)篩選大量克隆，所以大大提高找到稀少的高產(chǎn)克隆的概率。

3、高效率也大大減少人力，增加雜交瘤篩選的通量，同一時(shí)間可以運(yùn)作更多項(xiàng)目。

4、由于快速篩選更高水平克隆用于下游生產(chǎn)，同時(shí)盡可能早的丟棄掉低產(chǎn)的克隆，將目標(biāo)專注于稀少的高產(chǎn)克隆，也避免了有限稀釋，大大減少下游生產(chǎn)成本；同時(shí)節(jié)省耗材。

作為雜交瘤篩選的最新技術(shù)，也存在一些缺點(diǎn)。比如，首先雜交瘤要能在半固體培養(yǎng)基上生長良好，所以，合適的培養(yǎng)基就尤為重要。其次，克隆的大小和密度對(duì)于自動(dòng)化挑取克隆的精確性有很大影響。克隆太小，會(huì)影響識(shí)別和挑取�？寺√�密，容易影響挑到克隆的單克隆性。最后，機(jī)械臂對(duì)于挑選精度要求比較高，所以，設(shè)備的日常維護(hù)就非常重要。

在抗體藥物快速發(fā)展的今天，技術(shù)進(jìn)步對(duì)于快速篩選到特異性的雜交瘤就顯得非常重要，可以大大加快篩選進(jìn)程，縮短抗體藥物從研發(fā)到臨床及生產(chǎn)上市的周期。對(duì)于抗體行業(yè)的快速發(fā)展將起到不和缺少的推動(dòng)作用。