高通量篩選神經(jīng)毒性實(shí)驗(yàn)方案

優(yōu)點(diǎn)：

完全自動(dòng)化的圖像獲取與分析 

快速得到每個(gè)細(xì)胞的多表型參數(shù) 

實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活細(xì)胞的毒性，可持續(xù)幾分鐘至幾天

 

神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)許多毒性化合物以及自然環(huán)境中生成的有害物質(zhì)非常敏感。在疾病發(fā)生過程中，神經(jīng)毒性可以對(duì)大腦或者外周神經(jīng)系統(tǒng)造成短暫或持續(xù)性的損傷，例如脊髓損傷，中風(fēng)，創(chuàng)傷性腦損傷等。同時(shí)這種神經(jīng)毒性也是造成很多神經(jīng)退行性疾病諸如阿爾茲海默和帕金森的主要誘因。

 

誘導(dǎo)人多功能干細(xì)胞的高通量成像技術(shù)可以用于篩查候選藥物或者環(huán)境污染物的神經(jīng)營養(yǎng)，保護(hù)功能或者神經(jīng)毒性大小。本篇說明會(huì)闡述如何結(jié)合iPSCs，分子儀器和軟件自動(dòng)對(duì)誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞進(jìn)行終點(diǎn)法及活細(xì)胞的神經(jīng)毒性篩選。

 

誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞技術(shù)對(duì)我們研究神經(jīng)元毒性是十分有用的，iPSCs可以大批量的展示成熟神經(jīng)元的功能。如果將這種獨(dú)特的生物學(xué)相關(guān)的細(xì)胞類型和高通量成像分析結(jié)合在一起，我們就可以快速的篩選出在引起神經(jīng)元毒性中起主導(dǎo)作用的化合物并大大減少臨床前研究和相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的成本。此篇中用到的是Cellular Dynamics International公司完全分化的人神經(jīng)細(xì)胞。

 

高通量分析是一種定量化的分析方法，其可以測(cè)量神經(jīng)突觸長(zhǎng)度表征被測(cè)物的陽性或陰性作用。iPSC衍生的神經(jīng)元細(xì)胞可以在3-5天內(nèi)于96或者384孔板中形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，然后用毒性化合物刺激48-72小時(shí)。神經(jīng)網(wǎng)被ß-tubulin標(biāo)記后，可利用ImageXpress® Micro 寬敞成像系統(tǒng)獲取圖像。和抗抗體我們可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的可視化。使用MetaXpress® 圖像處理軟件中Neurite Outgrowth模塊和AcuityXpress™ 高內(nèi)涵數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)相關(guān)圖像和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

 

無論是否進(jìn)行了細(xì)胞核復(fù)染色，Neurite Outgrowth模塊都能找到神經(jīng)細(xì)胞胞體，并根據(jù)這些熒光標(biāo)記的神經(jīng)細(xì)胞軸突將之標(biāo)定為陽性細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)具有幾個(gè)重要的特征參數(shù)包括軸突數(shù)目，軸突長(zhǎng)度，每個(gè)細(xì)胞或者區(qū)域的分支數(shù)。我們可以針對(duì)每個(gè)孔的相關(guān)數(shù)據(jù)和細(xì)胞表型進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)。

 

上左：對(duì)照和高濃度藥物的Neurite Outgrowth模塊分析圖像結(jié)果，藍(lán)色為核，綠色為ß-tubulin III標(biāo)記的神經(jīng)突觸。上右：毒性化合物的總突觸計(jì)量反應(yīng)曲線。下：由總突觸計(jì)量反應(yīng)曲線計(jì)算出的IC50值。

 

 

上：對(duì)照和Antimycin A處理的神經(jīng)元細(xì)胞圖像，細(xì)胞被JC-10染色。圖像所示為20倍鏡拍攝。下：計(jì)量反應(yīng)曲線繪制依據(jù)每個(gè)細(xì)胞平均線粒體/顆粒數(shù)比值。

 

線粒體膜的去極化過程被認(rèn)為是缺氧性損傷和細(xì)胞毒性的重要早期標(biāo)志，運(yùn)用JC-10染料可以對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行監(jiān)測(cè)。在正常細(xì)胞中，聚集在線粒體中的JC-10呈橘紅色，而當(dāng)線粒體內(nèi)膜電位降低后，JC-10則從線粒體中以單體形式釋放到細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)出綠色熒光。 用JC-10對(duì)神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行染色并用抗霉素或者氨基霉素處理30min，后兩者可以有效阻斷細(xì)胞的氧化呼吸過程及鈣離子過載。用戶可以自定義MetaXpress Software 中的Granularity模塊來識(shí)別線粒體中JC-10的密度和大小。數(shù)據(jù)結(jié)果將被標(biāo)準(zhǔn)化到每個(gè)視野。

 

運(yùn)用Calcein AM和Hoechst核染料我們可以對(duì)活細(xì)胞的毒性進(jìn)行檢驗(yàn)。ImageXpress Micro 系統(tǒng)可很好的控制培養(yǎng)板的溫度，CO2濃度以及濕度等環(huán)境因素，從而準(zhǔn)確的檢測(cè)化合物是否具有神經(jīng)毒性（圖3）。通過對(duì)比體內(nèi)檢測(cè)出的具有神經(jīng)毒性的化合物以及臨床數(shù)據(jù)，我們就可以對(duì)化合物的神經(jīng)毒理特性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

Calcein AM可以同時(shí)對(duì)活的神經(jīng)細(xì)胞胞體和外放的神經(jīng)纖維進(jìn)行染色。利用Neurite Outgrowth 應(yīng)用模塊分析神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，Cell Scoring 應(yīng)用模塊區(qū)分活體和死體神經(jīng)細(xì)胞。

 

上：圖片所示為不同濃度methyl mercury對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的毒性作用。Calcein AM的存在說明活細(xì)胞代謝活動(dòng)（綠色）。下左：毒性化合物的IC₅₀曲線，依據(jù)測(cè)量的神經(jīng)突觸和細(xì)胞核大小顯示的毒性所繪制。下右：Hoechst染色的細(xì)胞核被標(biāo)記為紅色。

 

Molecular Devices公司的ImageXpress Micro 系統(tǒng)，MetaXpress 軟件和 AcuityXpress 軟件完美的解決了如何篩選評(píng)估神經(jīng)元毒性化合物的問題�；罴�(xì)胞篩選技術(shù)和成熟的表型成像分析技術(shù)相結(jié)合可以有效的鑒別神經(jīng)毒性化合物，從而為早期的藥物研發(fā)提供強(qiáng)力支持。