利用iPSC衍生的肝細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)高內(nèi)涵肝細(xì)胞毒性檢測(cè)

 

 

藥物引發(fā)的肝毒性是造成肝損傷和急性肝衰竭的重要原因之一。因此如何高效的檢測(cè)藥物的有效性和安全性對(duì)于促進(jìn)藥物研發(fā)和減少藥物消耗至關(guān)重要。人誘導(dǎo)的多功能干細(xì)胞(iPSC)衍生的肝細(xì)胞具有典型的成熟細(xì)胞的特征和代謝形式，這對(duì)于我們用高內(nèi)涵篩選藥物是非常理想的。

雖然對(duì)于如何利用高內(nèi)涵進(jìn)行藥物篩選已經(jīng)有了很多標(biāo)準(zhǔn)的程序，但是對(duì)于如何通過(guò)圖像分析評(píng)估不同毒性卻仍然非常復(fù)雜且大多依靠經(jīng)驗(yàn)。本文中我們闡述了如何利用ImageXpress® Micro XL系統(tǒng)對(duì)多參數(shù)肝毒性進(jìn)行分析。每一個(gè)孔或者細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生多種化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)，而這些反應(yīng)可以用MetaXpress® 5軟件的自定義模塊進(jìn)行分析。

 

活性染色(例如Calcein AM)可以用來(lái)粗略的檢測(cè)活細(xì)胞中的化合物毒性。首先用各種化合物對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行72小時(shí)處理并染色。通過(guò)ImageXpress Micro XL 系統(tǒng)的10倍物鏡我們可以得到肝細(xì)胞的圖像， 然后我們用MetaXpress軟件的Multi-Wavelength Cell Scoring應(yīng)用模塊對(duì)活細(xì)胞的整個(gè)核區(qū)域(Hoechst復(fù)染色)和細(xì)胞質(zhì)區(qū)域(Calcein AM)進(jìn)行分析(圖1)。

 

 

 

線粒體去極化是缺氧損傷和氧化應(yīng)激的早期標(biāo)志。我們可以用JC-10對(duì)線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，雖然橙色的J-aggregates肉眼可見(jiàn)，但是對(duì)于膜去極化來(lái)說(shuō)，這種染料可以進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中并發(fā)出特定的熒光波長(zhǎng)。在用ImageXpress Micro XL系統(tǒng)成像前先用化合物處理肝細(xì)胞60分鐘并用JC-10染色。系統(tǒng)的自定義模塊可以對(duì)健康線粒體中保存的染料和滲透到細(xì)胞質(zhì)中的染料分別定量。通過(guò)分析這兩類熒光染色信號(hào)強(qiáng)度的比率我們可以得到比之前單一檢測(cè)更可靠的數(shù)據(jù)(圖2)。

 

 

 

一些藥物會(huì)引起磷脂質(zhì)病和脂肪變性，這是由脂肪代謝紊亂引起的組織中過(guò)多的磷脂質(zhì)和中性脂肪聚集造成的。我們可以用成像的方法對(duì)肝細(xì)胞中的磷脂質(zhì)和中性脂肪的分布進(jìn)行檢測(cè)，這一檢測(cè)可以精確到單細(xì)胞水平。圖3我們列舉的實(shí)驗(yàn)中肝細(xì)胞被種在384孔板24小時(shí)后，用待測(cè)化合物處理孵育了4天。

 

 

 

MetaXpress軟件中的自定義模塊編輯器可以讓科學(xué)家們針對(duì)自己感興趣的參數(shù)進(jìn)行復(fù)雜的分析。這種自定義模塊已被證明可以有效的定量細(xì)胞大小，形狀，不同細(xì)胞的總數(shù)以及凋亡情況(圖4)。這些模塊也可以應(yīng)用在圖像處理上，還可以用MetaXpress.PowerCore. High Content Distributed Image Analysis Software對(duì)大量樣本進(jìn)行高通量篩選分析。

 

 

多參數(shù)圖像分析可以顯著的提高分析的靈敏性，并且為我們進(jìn)一步了解化合物毒性發(fā)生機(jī)制提供更多信息。利用MetaXpress 5軟件的自定義模塊編輯器，科學(xué)家們可以自由的設(shè)計(jì)和調(diào)整圖像分析模塊并迅速的對(duì)毒性進(jìn)行分析及得到相應(yīng)結(jié)果。Molecular Devices®為評(píng)估肝細(xì)胞毒性提供了非常人性化的高內(nèi)涵篩選方法，這種方法大大領(lǐng)先于傳統(tǒng)的非死即活的簡(jiǎn)單檢測(cè)。