利用SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機檢測功能對于細胞活力和細胞毒性的評價

1.儀器具有超高靈敏度化學發(fā)光檢測功能，最低至10個細胞/每孔

2.微孔板讀板高度自動優(yōu)化設置，可提高檢測信號強度 軟件預置

3.軟件預置模板可以更快分析出檢測結果

 

SpectraMax i3x是Molecular Devices公司最新推出的一款多功能微孔板讀板機，可利用儀器所具有的化學發(fā)光檢測功能，進行細胞活力和細胞毒性相應檢測。儀器可靈敏、快速檢測出培養(yǎng)基中活細胞的數(shù)目和經(jīng)相應處理后細胞毒性情況。Promega公司推出的CellTiter-Glo試劑是利用了螢火蟲熒光素酶反應體系中需要ATP參與才能使其發(fā)光的特點，化學發(fā)光信號強弱取決于培養(yǎng)基中ATP含量的高低，也就是依賴于其中活細胞數(shù)目的多少。來自于BioVision公司基于生物化學發(fā)光原理的細胞毒性檢測試劑盒，目的是檢測腺苷酸激酶(AK)的含量，AK為一種存在于所有細胞中的常見蛋白，當破壞了細胞膜完整性后其會釋放至培養(yǎng)基中，AK可轉化ADP至ATP，所以可以利用類似方式進行化學發(fā)光檢測。

 

. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega P/N G7570)

. Bioluminescence Cytotoxicity Assay Kit (BioVision P/N K312-500)

. HeLa .細胞(ATCC P/N CCL-2)

. 黑色底透 96孔細胞培養(yǎng)板(Corning P/N 3904)

. 白色96孔細胞培養(yǎng)板(Corning P/N 3917)

. SpectraMax i3x多功能微孔板讀板機

 

使用前預先將CellTiter-Glo緩沖液和底物解凍并且平衡其至室溫，將CellTiter-Glo緩沖液加至含有CellTiter-Glo底物的棕色小瓶中，按照試劑盒說明書提示，將試劑輕輕反復顛倒進行混勻。對于生物化學發(fā)光細胞毒性檢測試劑盒，其中包含了1瓶AK檢測試劑，此試劑使用前預先將1.1ml AK試劑緩沖液加入其中并輕輕混勻，需在室溫環(huán)境下平衡15分鐘后使用。這個10X的AK試劑的儲存液需要稀釋后才能成為試劑緩沖液。

Hela 細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清和雙抗的MEM培養(yǎng)基中，細胞經(jīng)胰酶消化后，使其懸浮于培養(yǎng)基中進行計數(shù)。處理后的細胞鋪在96孔板中，經(jīng)細胞培養(yǎng)基稀釋后其密度從50,000細胞每孔/100ul至10個細胞每孔/100ul。如果將細胞鋪在384孔板時，稀釋后密度從12,500細胞每孔/25ul至6個細胞每孔/25ul。對照孔中僅需加入細胞培養(yǎng)基用于檢測其背景的化學發(fā)光信號值。

細胞試驗過程中，精確的細胞數(shù)目可用于生成標準曲線，將不同體積的CellTiter-Glo試劑加入相應的孔板中，如100ul(96孔板)或25ul(384孔板)。將微孔板放置于振蕩器上輕混2分后，室溫條件下孵育10分鐘，等化學發(fā)光信號值穩(wěn)定后再進行檢測。

 

ATP以1:10稀釋度進行稀釋后加入96孔板和384孔板中，濃度從10uM至1nM，不加細胞的孔作為空白孔。CellTiter-Glo試劑可用于檢測ATP，檢測前可利用SpectrMax i3x具有的微孔板優(yōu)化設置和讀取高度優(yōu)化設置功能，幫助你獲得更佳信號值。

 

將Hela細胞預鋪在白色底透的細胞培養(yǎng)型96孔板中，密度為15,000/孔，培養(yǎng)過夜。第二天在細胞孔中加入十字孢堿(staurosporine)和茴香霉素(anisomycin)這兩種化合物來誘導細胞凋亡。這兩種化合物起始濃度都為50uM，并以1:2方式稀釋至24nM。再經(jīng)過24小時孵育以后，分別使用CellTiter-Glo細胞活力檢測試劑盒和BioVision的細胞毒性檢測試劑盒對處理后的細胞進行檢測。

對于CellTiter-Glo細胞活力檢測試驗，將100ul的CellTiter-Glo試劑加入含有細胞的白色微孔板中，等10分鐘左右，當細胞徹底裂解以后再進行相應檢測。

 

對于BioVision細胞毒性檢測試驗，每孔中取100ul處理后的細胞培養(yǎng)基，將其轉移至白色微孔板中，并在白色微孔板中加入100ul的AK工作液，此方法需要在30分鐘內(nèi)完成檢測。

SpectraMax i3x讀板機參數(shù)設置如表一所示。使用專業(yè)級別的SoftMax. pro軟件后，可直接獲得平均相對化學發(fā)光信號值(RLU)和標準偏差值。直接繪制出細胞稀釋度曲線和ATP標準曲線，選擇其中的4參數(shù)擬合方式進行擬合后快速計算出其IC₅₀值。軟件預置模板庫中還有針對CellTiter-Glo檢測試驗的模板可方便直接調(diào)用。

 

 

SpectraMax i3x讀板機針對96孔板和384孔板進行檢測時，最低檢測下限可至10細胞每孔。此種檢測方法的靈敏度遠遠高于標準比色法和絕大多數(shù)熒光法。CellTiter-Glo試劑檢測線性范圍覆蓋所有細胞濃度區(qū)間，動態(tài)學檢測范圍大于3個數(shù)量級且r2 > 0.99（圖一）。

 

 

ATP標準曲線既可以驗證試驗條件也可以用來計算細胞內(nèi)ATP的含量。因此ATP標準品濃度范圍從1nM至10uM產(chǎn)生的化學發(fā)光信號范圍可覆蓋整個不同細胞數(shù)目孔中產(chǎn)生的信號值(圖二)，檢測的線性范圍大于四個數(shù)量級。

 

 

經(jīng)十字孢堿(staurosporine)和茴香霉素 (anisomycin)等化合物處理后細胞其活力的變化可通過檢測ATP水平而實現(xiàn)(圖三)。細胞毒性可以通過檢測其AK量變化而實現(xiàn)(圖四)。十字孢堿(0.34uM和0.15uM)和茴香霉素(3.30uM和2.28uM)兩次處理試驗獲得相似的IC₅₀值。

 

 

 

 

 

在利用SpectraMax i3x讀板機化學發(fā)光檢測功能進行基于ATP變化的細胞活力和基于AK變化的細胞毒性檢測時其表現(xiàn)出了超高靈敏性，檢測下限可至10個細胞每孔�？赏ㄟ^專業(yè)級別的SoftMax Pro 軟件進行四參數(shù)擬合，隨后直接計算出IC50值。軟件可以自動優(yōu)化微孔板的檢測高度，可幫助用戶獲得最佳的信號值。

主機除了具有化學發(fā)光檢測功能以外，SpectraMax i3x讀板機可升級具有更多檢測功能以滿足用戶對不同試驗的不同檢測需求。此儀器的光吸收和熒光強度檢測功能， 光源采用了專利的光譜融合技術(Spectra FusionTM Illmumination)使其既可以兼顧了波長靈活性也可以獲得最佳檢測信號。

主機可加入具有新檢測功能的卡盒，用戶自己可隨時進行功能升級，包括時間分辨熒光檢測功能和Western Blot檢測功能，也可選配Spectra. MiniMaxTM 300細胞成像模塊，擴展此讀板機檢測能力和應用范圍。儀器所有功能均可以使用一種軟件進行操作，即專業(yè)級別的SoftMax Pro軟件，其中包含了CellTiter-Glo等近120預置檢測模板可方便用戶自己快速進行數(shù)據(jù)收集和數(shù)據(jù)分析。