在MD兩款酶標(biāo)儀上應(yīng)用Promega CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光法檢測細(xì)胞活性

 

Molecular Devices公司的SpectraMax® L及SpectraMax®M5型號酶標(biāo)儀結(jié)合Promega公司的CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒能進行快速靈敏的活細(xì)胞數(shù)量測定。CellTiter-Glo檢測法使用了螢光素酶，需要ATP使其反應(yīng)發(fā)光。發(fā)光信號強度由ATP量決定，而ATP的多少取決于活細(xì)胞數(shù)目。SpectraMax® L及M5酶標(biāo)儀均能提供96孔和384孔化學(xué)發(fā)光檢測功能。

 

CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒(Promega公司，貨號G7570)，包括CellTiter-Glo緩沖液和CellTiter-Glo底物(凍干粉)

CHO-K1細(xì)胞(ATCC，貨號CCL-61)

白色96和384孔板(Greiner Lumitrac 200，貨號655075和781075)

SpectraMax® L化學(xué)發(fā)光微孔板檢測儀或SpectraMax® M5多功能微孔板讀板機

 

準(zhǔn)備CellTiter-Glo試劑使用前將CellTiter-Glo緩沖液和底物在室溫中平置解凍。然后將緩沖液倒入裝有底物的棕色瓶中，并按照CellTiter-Glo操作手冊中指示，溫和顛倒瓶子以混勻。

 

用含10%胎牛血清和L-谷氨酰胺的Ham’sF12培養(yǎng)基培養(yǎng)CHO-K1細(xì)胞。胰酶消化后使細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，并進行細(xì)胞計數(shù)。用96孔板檢測時，每孔中加入100ul細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度從50000個/孔稀釋到24個/孔。384孔進行檢測時，每孔中加入25ul懸液，細(xì)胞濃度從12500個/孔稀釋到25個/孔。空白孔中加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)基，用于檢測背景光值。

 

為了確保CellTiter-Glo檢測中細(xì)胞數(shù)量的準(zhǔn)確性，細(xì)胞不能貼壁和生長，但能及時被檢測到。每孔中加入100ul(96孔板)或25ul(384孔板)CellTiter-Glo試劑。然后將微孔板放在振蕩器上溫和振蕩混勻2分鐘，室溫孵育10分鐘，使其產(chǎn)生穩(wěn)定的發(fā)光信號。

 

ATP標(biāo)準(zhǔn)樣品用培養(yǎng)基制備，濃度范圍從100 fmol/孔到1nmol/孔(96孔板)，或25 fmol/孔到250 pmol/孔(384孔板)，按上述同樣體積加入微孔板中。空白對照孔加入不含ATP的培養(yǎng)基。適量CellTiter-Glo試劑加入每孔，并按上述步驟孵育。

 

檢測板用SpectraMax® L和SpectraMax®M5酶標(biāo)儀進行讀數(shù)，并使用SoftMax® Pro軟件中預(yù)設(shè)參數(shù)的CellTiter-Glo模板。根據(jù)Promega推薦，檢測時間設(shè)置為1秒。然后在SoftMax® Pro軟件上進行平均發(fā)光強度和標(biāo)準(zhǔn)偏差計算，細(xì)胞濃度稀釋曲線和ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線作圖。

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均最低能檢測24個細(xì)胞/孔(96孔板)和6個細(xì)胞/孔(384孔板)。因此其靈敏度高于比色法和熒光檢測法。CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)光檢測值在所用的細(xì)胞濃度范圍內(nèi)呈線性分布，并達到大于3個數(shù)量級的動態(tài)范圍(r2= 0.99)。(見圖1)

 

ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線能用于驗證試劑盒以及計算細(xì)胞ATP含量。ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線中ATP濃度范圍對應(yīng)檢測值覆蓋了細(xì)胞數(shù)量檢測中的發(fā)光值全部范圍(見圖2)。檢測值至少在4個數(shù)量級范圍內(nèi)呈線性。

 

 

 

 

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均為CellTiter-Glo檢測提供了優(yōu)異的檢測靈敏度。SpectraMax® L化學(xué)發(fā)光讀板機帶有自動增益功能，能同時進行模擬信號和光子計數(shù)，提供大于9個數(shù)量級的動態(tài)范圍，對于高信號值樣品無需稀釋，同時對于低信號樣品具有優(yōu)越的靈敏度。

 

SpectraMax® M5多功能讀板機為使用者提供了除化學(xué)發(fā)光以外的其他檢測方法，例如：光吸收，熒光強度，熒光偏振和時間分辨熒光。

 

SpectraMax® L和SpectraMax® M5酶標(biāo)儀均用SoftMax® Pro軟件進行操控和設(shè)置，該軟件含有CellTiter-Glo檢測模板和其他120多個分析模板，這些模板已預(yù)設(shè)參數(shù)，方便數(shù)據(jù)整理和分析。兩種酶標(biāo)儀均能整合MD公司的StakMax®微孔板移動機械臂，以實現(xiàn)微孔板的自動裝卸。