基因工程，黃金對(duì)比：六大病毒載體技術(shù)的比較；不同基因傳遞方法的比較

瀏覽次數(shù)：1921　發(fā)布日期：2015-7-15　來(lái)源：銳賽生物

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病毒載體
經(jīng)典的病毒載體主要有四類，腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒。他們具備侵染細(xì)胞譜廣，效率高等特點(diǎn)并廣為研究人員熟知。它們的特點(diǎn)總結(jié)歸納如表一。
表一：六大病毒載體技術(shù)的比較

載體	感染廣譜性	靶細(xì)胞類型	表達(dá)形式	表達(dá)時(shí)間	免疫原性	外源片段容量(Kb)	滴度(TU/ml)	缺點(diǎn)
腺病毒載體	高	分裂和非分裂	非整合	2-4周	高	36	1012	免疫原性高，瞬時(shí)表達(dá)
腺相關(guān)病毒載體	中	非分裂為主分裂	非整合為主;整合	數(shù)年	無(wú)	4	1012	外源片段容量小
逆轉(zhuǎn)錄病毒載體	中	分裂	整合	數(shù)年	低	8	108	不能感染非分裂細(xì)胞
慢病毒載體	高	分裂和非分裂	整合	數(shù)年	低	5－8	1010	外源片段容量小
狂犬病病毒載體	對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞侵染效率高	分裂和非分裂	整合		無(wú)
昆蟲桿狀病毒載體	中	分裂	整合	數(shù)年	低		1012	感染譜數(shù)據(jù)庫(kù)還有待豐富

病毒載體介導(dǎo)的基因傳遞的優(yōu)勢(shì)
通過(guò)表二，可以發(fā)現(xiàn)病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)方法相比非病毒載體，具備高效，廣譜，長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)以及能用于動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞等幾乎所有優(yōu)點(diǎn)。

表二：不同基因傳遞方法的比較

載體/方法	適用靶細(xì)胞類型	基因傳遞廣譜性	動(dòng)物體內(nèi)基因傳遞能力	操作便捷性	細(xì)胞毒性	長(zhǎng)期表達(dá)能力	引起免疫反應(yīng)
化學(xué)試劑	1，部分貼壁細(xì)胞 2，部分懸浮細(xì)胞	低	極低	高	低到中	低	低
電轉(zhuǎn)	1，部分懸浮細(xì)胞 2，部分貼壁細(xì)胞	中	可操作性低	中	低到中	低	無(wú)
病毒載體	1，幾乎所有貼壁細(xì)胞 2，幾乎所有懸浮細(xì)胞 3，幾乎所有非分裂細(xì)胞	高	高	高	低	高	低到中

病毒制備和感染：
腺病毒：
腺病毒基因組非常大，而且酶切位點(diǎn)非常少，導(dǎo)致很難直接制備腺病毒載體。通常通過(guò)使用穿梭載體在細(xì)菌或者包裝細(xì)胞系內(nèi)進(jìn)行重組從而將外源片段轉(zhuǎn)移到病毒基因組中。
慢病毒：
外源插入片段一旦被克隆至慢病毒載體后，其兩側(cè)為長(zhǎng)片段重復(fù)序列(LTR)以及
腺相關(guān)病毒：
腺相關(guān)病毒載體含有反向末端重復(fù)序列(ITR)。輔助質(zhì)粒用來(lái)表達(dá)病毒包裝必須基因(E2A, E4 VA and E1)。

注意事項(xiàng)：
插入片段大小和插入片段性質(zhì)因素：一些插入片段的表達(dá)由于對(duì)宿主或者包裝細(xì)胞系有毒性從而使得滴度比較低。在這種情況下，使用誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。還有一些插入片段太大或者太小都可能導(dǎo)致病毒包裝效率不高。添加輔助序列增加插入片段的大小或者對(duì)病毒進(jìn)行濃縮純化提高滴度。插入片段如果過(guò)大可以選擇容量更大的病毒包裝系統(tǒng)。
小竅門：
構(gòu)建分子病毒載體時(shí)，使用recA-細(xì)菌擴(kuò)增病毒分子載體。當(dāng)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞時(shí)，盡可能使用傳代次數(shù)低的細(xì)胞。
注意事項(xiàng)：
使用純度盡可能高的質(zhì)粒，最理想的是經(jīng)過(guò)氯化銫密度梯度離心純化的質(zhì)粒。收獲病毒后，推薦進(jìn)行病毒濃縮并使用病毒純化試劑盒或者氯化銫密度梯度離心純化。
小竅門：
用病毒去感染細(xì)胞時(shí)，加入polybrene會(huì)增加感染效率
小竅門：
將病毒凍存在-80°C。但盡量減少凍融次數(shù)，推薦分裝成單次使用量的小容量包裝。避免反復(fù)凍融3次以上。

表三：化學(xué)，物理和病毒載體方法進(jìn)行基因傳遞的具體優(yōu)缺點(diǎn)比較

基因傳遞方法優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)

病毒載體 • 高感染效率，廣譜性高 • 制備復(fù)雜
                           • 適合大規(guī)模實(shí)驗(yàn)操作 • 對(duì)病毒載體質(zhì)量要求高
                           • 能高效感染體內(nèi)細(xì)胞 • 需要低溫(-80°C )儲(chǔ)存
                           • 可以在體內(nèi)感染特定細(xì)胞 • 價(jià)格偏高
                           • 易篩選細(xì)胞穩(wěn)定株 • 部分病毒載體對(duì)基因大小有容量限制

化學(xué)方法 • 部分細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高 • 廣譜性不高
                           • 易操作 • 部分試劑毒性大
                           • 對(duì)轉(zhuǎn)染基因大小容量限制小               • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染效果差
                           •  試劑穩(wěn)定，易儲(chǔ)存

物理方法 •  對(duì)大部分體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高            • 需要購(gòu)買昂貴設(shè)備
                           •  易操作 • 體內(nèi)轉(zhuǎn)染可操作性差
                           •  不受基因大小限制 • 部分原代，非分裂細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果差

為什么是shRNA？
外源導(dǎo)入的siRNA結(jié)合RISC復(fù)合物的能力要比shRNA低10倍，雖然將siRNA的長(zhǎng)度增加到29-30 nt可以增加結(jié)合RISC復(fù)合物的效率，但也增加了off target效應(yīng)，引起更多的非專一性基因干擾。shRNA由于模擬microRNA的作用通路，所以相比siRNA其基因沉默效率更高。siRNA和shRNA的優(yōu)缺點(diǎn)見表四。銳賽選擇使用病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾，并通過(guò)構(gòu)建shRNA穩(wěn)定株，能最大程度的避免使用體外化學(xué)合成的siRNA所帶來(lái)的一系列問(wèn)題。

		siRNA	shRNA	雙功能shRNA
RNA干擾片段運(yùn)輸	進(jìn)入體外細(xì)胞難易程度	中等 (轉(zhuǎn)染效率依細(xì)胞而定，差異大)	容易 (使用病毒載體)	容易 (使用病毒載體)
	進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi) 細(xì)胞難易程度	低 (轉(zhuǎn)染效率依組織特性而定，且需要較高劑量，可能引起off target效應(yīng))	容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低)	容易 (使用病毒載體，發(fā)揮功能需要的拷貝數(shù)低)
	進(jìn)入細(xì)胞的方式	化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染	化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)	化學(xué)試劑轉(zhuǎn)染；病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)
	細(xì)胞內(nèi)代謝速度	強(qiáng)(48小時(shí)內(nèi)99%被降解)	弱	弱
作用機(jī)制	結(jié)合RISC復(fù)合物能力	弱	強(qiáng) (10倍強(qiáng)于siRNA)	超強(qiáng)
作用機(jī)制	達(dá)到沉默效果需要的拷貝數(shù)	高	低 (5個(gè)拷貝左右即可)	超低
脫靶效應(yīng) (off target effects)	化學(xué)修飾能力a	易修飾;修飾價(jià)格昂貴	無(wú)法修飾	無(wú)法修飾
	免疫信號(hào)通路反應(yīng)	中 (通過(guò)細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)涵體通路激活先天性免疫系統(tǒng))	弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng))	弱 (由于使用與內(nèi)源miRNA相似的干擾系統(tǒng))
	外源核酸對(duì)細(xì)胞的毒性	中	弱	弱
	對(duì)細(xì)胞內(nèi)源RNA干擾系統(tǒng)的影響	中 (過(guò)量siRNA會(huì)增加飽和exportin-5運(yùn)輸內(nèi)源miRNA能力的風(fēng)險(xiǎn)性)	中(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會(huì)增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風(fēng)險(xiǎn)性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)	中(瞬時(shí)轉(zhuǎn)染引入的高劑量shRNA會(huì)增加飽和內(nèi)源miRNA降解能力的風(fēng)險(xiǎn)性)，低(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染)
表達(dá)可調(diào)控性	可控表達(dá)程度 (時(shí)間和空間)	低(可以通過(guò)結(jié)合特定的小分子或者大分子達(dá)到特異進(jìn)入某類組織細(xì)胞的目的，但無(wú)法做到可誘導(dǎo)沉默)	高 (更換啟動(dòng)子)	高 (更換啟動(dòng)子)
安全性	體外和動(dòng)物體內(nèi)	高	高	高
安全性	臨床	中	中	中

a: 1) 改善off target效應(yīng); 2) 提高細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性

表六：不同轉(zhuǎn)染方法介導(dǎo)的穩(wěn)定整合參數(shù)比較

穩(wěn)定整合參數(shù)	化學(xué)轉(zhuǎn)染法	物理轉(zhuǎn)染法	病毒載體法						轉(zhuǎn)座子
	磷酸鈣轉(zhuǎn)染	電轉(zhuǎn)	逆轉(zhuǎn)錄病毒 (MLV)	慢病毒		腺相關(guān)病毒(Rep-)		腺病毒	睡美人轉(zhuǎn)座子
整合幾率(integration event/PFU/cell)	10-8	10-6	10-2-10-1	10-2-10-1		10-3		10-6-10-4	10-2
整合位點(diǎn)	重復(fù)序列片段	非核基質(zhì) -嚕噗區(qū)	核基質(zhì)區(qū)			CpG島; 核糖體重復(fù)序列		由于整合率極低，所以很少研究	TA位點(diǎn) (染色體附近結(jié)構(gòu)決定)
			轉(zhuǎn)錄起始區(qū)	活躍表達(dá) 基因內(nèi)					轉(zhuǎn)錄活躍區(qū) 表達(dá)調(diào)控區(qū)
整合位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄活躍度	低	低	高	高		中			高
穩(wěn)定性	弱	中	強(qiáng)						強(qiáng)
拷貝數(shù)	多拷貝串聯(lián)分布5-數(shù)百個(gè)拷貝	30%單拷貝	通過(guò)控制病毒載體用量可以達(dá)到單拷貝						通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件可以達(dá)到單拷貝
獲得單拷貝細(xì)胞株的難易程度	難	中	易		易		易		易
表達(dá)強(qiáng)度/拷貝	低	低	高		高		高		高
插入失活宿主內(nèi)源基因	低	低	低		高		仍處于研究中		高
插入激活宿主內(nèi)源基因	低	低	高		低				低

表七：不同病毒載體介導(dǎo)的基因傳導(dǎo)的特性比較

	腺病毒載體	腺相關(guān) 病毒載體	逆轉(zhuǎn)錄病毒載體	慢病毒載體	狂犬病病毒載體	桿狀病毒載體
表達(dá)形式	染色體外，瞬時(shí)表達(dá)	染色體外，長(zhǎng)期表達(dá)	整合	整合	整合	染色體外，瞬時(shí)表達(dá)
表達(dá)周期	2-4周	數(shù)月至數(shù)年	>1年	>1年	>1年
感染細(xì) 胞類型	分裂和非分裂細(xì)胞	分裂和非分裂細(xì)胞	分裂	分裂和非分裂細(xì)胞	分裂和非分裂細(xì)胞	昆蟲細(xì)胞; 哺乳動(dòng)物分裂細(xì)胞
細(xì)胞侵染廣譜性	廣	對(duì)體內(nèi)分化組織細(xì)胞侵染效果更好	廣	廣	高效感染腦神經(jīng)細(xì)胞	中
可容納外源片段大小	36kb	4kb	8kb	5-8kb
滴度 (TU/ml)	1012	1012	108	1010		1012
病毒制備難易程度	中	難	中	中	中	中
常見應(yīng)用	1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 2，基因治療	1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，動(dòng)物模型; 3，基因治療	1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，全基因組插入失活突變篩選; 3，功能細(xì)胞庫(kù)構(gòu)建	1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，基因治療	1，體外細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo); 2，基因治療	1，真核細(xì)胞蛋白表達(dá)(表達(dá)可溶性蛋白)
安全性	高	高	中	高	中	高

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