葡萄糖在小鼠克隆胚胎發(fā)育中的作用

實驗步驟

1. 克隆胚胎制備和胚胎培養(yǎng)

卵母細胞在含有5.5mM葡萄糖的CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)。用含有5.5mM葡萄糖和2.5ug/ml 細胞松弛素B的HEPES-CZB液(HCZB)作為工作液，卵母細胞在此液中被去掉紡錘體-染色體復(fù)合體；用卵丘細胞作為核供體。用注射針反復(fù)吸入、吹出卵丘細胞，以除去其細胞膜和大部分細胞質(zhì)，然后用注射針將裸卵的核注入去除紡錘體-染色體復(fù)合體的卵母細胞中。

孤雌胚胎所用的卵母細胞與用于制備核移植胚胎的卵母細胞來源相同。

孤雌胚胎和核移植胚胎用不含Ca2 、卻含10mM Sr2 和細胞松弛素B的CZB培養(yǎng)液進行激活。所有步驟中都不使用二甲基亞砜，以避免其對克隆胚胎造成的不受控制的影響。單細胞正常受精胚胎是通過超排的(B6D2)F1雌鼠和(B6D2)F1雄鼠交配獲得的。

所有胚胎用Whitten 培養(yǎng)液(MW)培養(yǎng)。之所以選擇此培養(yǎng)液是因為利用(B6D2)F1小鼠卵母細胞制備的受精胚胎、孤雌胚胎和核移植胚胎在此種培養(yǎng)液中更利于它們除了二細胞期之外的胚胎發(fā)育。對正常胚胎發(fā)育有更好的促進作用的其他培養(yǎng)液，對克隆胚胎卻有阻滯作用，所以不被采用。

2. 分析葡萄糖代謝

胚胎在WM中過夜培養(yǎng)，到單細胞后期或二細胞中期時用來進行葡萄糖代謝分析。我們利用[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，來分析葡萄糖代謝情況。使用[1-14C]葡萄糖時，14 CO2 經(jīng)過戊糖磷酸途徑或三羧酸循環(huán)釋放。使用[6-14C]葡萄糖時，14 CO2僅通過三羧酸循環(huán)釋放。使用[5-3H]葡萄糖時，3 H2O 僅通過糖酵解途徑釋放。14CO2和3H2O用一種裝置收集然后通過一種方法進行量化。通過比較三種不同位置同位素標記的葡萄糖的代謝率，可以確定不同途徑的代謝率。為了準備用于測量代謝的培養(yǎng)液，我們在真空條件下冷凍適量的[1-14C]葡萄糖、[6-14C]葡萄糖、[5-3H]葡萄糖，然后用不含葡萄糖的HCZB進行溶解。用冷的非放射性葡萄糖將溶液中葡萄糖的含量增加至4mM。

根據(jù)放射性物質(zhì)的放射性強弱，將5-20枚胚胎放到1ml注射器的空心活塞中。注射針管中放有600ul 0.1M 的NaOH，用來捕獲胚胎釋放出的14 CO2 和3 H2O 。將裝有胚胎的活塞推入注射器，蓋上針帽。此簡易裝置與Eppendorf懸滴系統(tǒng)相比，兩者在敏感度和檢測準確度上并沒有差異，但是我們發(fā)現(xiàn)前者在將檢測物質(zhì)放入注射器時，不會發(fā)生很大的傾斜，并且放入物質(zhì)能夠很快的有效聚集在一起。經(jīng)過37°C、3h的孵育后，小心的將NaOH捕獲液轉(zhuǎn)移到發(fā)光瓶中，1h后，確定代謝物種輻射量的多少。每次試驗，都要有四個空白對照(不放胚胎)，但含有5ul HCZB，在同樣的條件下進行孵育，用以說明葡萄糖降解的原因，也用于進行下一步的計算。

計算出葡萄糖降解的效率，并用每枚胚胎每小時降解多少皮摩爾表示出來。每次試驗至少重復(fù)三次，每次試驗所用胚胎數(shù)為3-6枚。

3. 酶和代謝分析

用冷凍干燥法處理胚胎，然后用來進行酶和代謝分析。每枚胚胎在油下進行萃取，并用來進行酶循環(huán)分析。計算每個胚胎中各自的ATP含量。相似的，計算每個胚胎內(nèi)部的糖原水平。腺苷酸酶和糖原合酶的分析在前邊已經(jīng)介紹了。所有代謝的計算，都用每千克濕重含有多少mmole物質(zhì)表示(每枚胚胎重160ng或160pl)。每次試驗至少重復(fù)三次，每種胚胎最后分析數(shù)量必須達到10-20枚。

4. 線粒體拷貝數(shù)量

利用熒光定量PCR，檢測線粒體DNA(mtDNA)與核DNA(nDNA)的比率，從而間接測定mtDNA的含量。所用的mtDNA引物：5-CAGGATGAGCCTCAAACTCC-3(上引物)和5-GGTCAGGCTGGCAGAAGTAA-3(下引物) 。所用的nDNA引物(18S核糖體RNA)：5-TCGAGGCCCTGTAATTGGAA-3(上引物)和5-CCCTCCAATGGATCCTCGTT-3(下引物)。每枚單個胚胎放入0.2ml PCR管中，其中含有1ul 17uM SDS和 2ul 125ug/ml 蛋白酶K，37°C孵育過夜，然后95°C 15min 用以使蛋白酶失活。

5. 線粒體的超微結(jié)構(gòu)

從每個處理組取五枚胚胎，用2%多聚甲醛和0.6%戊二醛的混合物固定，然后用含有1%四氧化鋨的二甲基胂酸鈉進行后固定，再用一系列濃度逐步升高的乙醇對其進行脫水處理，然后用PolyBed 812 樹脂包埋。用切片機制備超薄切片，將切片放到銅網(wǎng)上，用醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色，然后放到Ieol 1200 EX 顯微鏡下進行觀察。至少每個處理組的三枚胚胎用來進行主觀上的線粒體形態(tài)學上的評定，并用好、中、差來表示。

6. MitoTracker 染色和分析

為了能夠看到有活性的線粒體，胚胎在含有葡萄糖的WM液(WM-)中或不含葡萄糖的WM液(WM )中孵育30min，上述兩液均含有500nM 氯甲基-四甲基-rosamine(MitoTracker，分子探針)。MitoTracker是對活性線粒體特異的熒光探針。樣本經(jīng)上述處理后，在培養(yǎng)液中洗60min，然后用4%多聚甲醛固定30min。此染色法是可見的，胚胎顯微鏡(Eclipse 800; Nikon Instruments,Melville, NY)拍照。上述顯微鏡配備有表面熒光和不同干涉相差光學系統(tǒng)。顯微鏡放大倍數(shù)為 X60，聚焦于每枚胚胎最長的直徑上；用Cool Snap 相機和 MetaMorph 7.1.0.0 軟件系統(tǒng)取相。線粒體形態(tài)學分析用MetaMorph中的形態(tài)學分析工具進行分析。手動記錄每枚胚胎的周長(每個胚胎階段，每個處理組都要分析五枚胚胎)，記錄周長的相關(guān)像素強度值都會被軟件記錄，將這些值錄入Microsoft Excel以計算每個階段、每個處理組的平均值。