看MRC的科學(xué)家如何快速、直接進(jìn)行大分子結(jié)晶條件優(yōu)化

 

X-ray晶體學(xué)方法是目前獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的最有效手段。但是想要從純化的蛋白、核酸或是大分子復(fù)合物獲得晶體需要面臨巨大的挑戰(zhàn)。與繁復(fù)冗長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)置和過程相伴的往往是極低的實(shí)驗(yàn)成功率。首先，研究者會(huì)用購買商品化的試劑盒，在一個(gè)廣泛的范圍內(nèi)對(duì)純化的樣品進(jìn)行一輪結(jié)晶條件的初步篩選。然后，再根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行一輪優(yōu)化篩選，以便重復(fù)和改善初步篩選時(shí)獲得的結(jié)果。通過優(yōu)化的條件，得到高質(zhì)量的晶體，就可以獲得可靠的X-ray衍射數(shù)據(jù)，從何解析出高分辨率的結(jié)構(gòu)。

 

通常，優(yōu)化篩選使用傳統(tǒng)的液體加樣器，由手工來完成。整個(gè)過程會(huì)非常地耗時(shí)。另外，常用的儲(chǔ)液含有低表面張力或是高粘度的組份，如PEGs。這些因素經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致加樣不準(zhǔn)確和交叉污染的發(fā)生。

 

MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家使用英國(guó)TTP Labtech全新研發(fā)的全自動(dòng)液體處理工作站—dragonfly，輕松克服了上述阻礙，全自動(dòng)優(yōu)化得到了三種不同蛋白質(zhì)樣本的結(jié)晶。這臺(tái)創(chuàng)新型的儀器使用固相置換技術(shù)和非接觸式加樣原理，不僅可以杜絕交叉污染的發(fā)生，對(duì)所有類型的液體（包括極其粘稠的甘油）當(dāng)加樣精度達(dá)到1 μL級(jí)別時(shí)，CV值都控制在5%以內(nèi)，確保準(zhǔn)確加樣。研究人員可以在任意一種SBS加樣板中，快速簡(jiǎn)便地制備自己需要的篩選條件。一塊包含96種篩選條件的加樣板，可以在3-6分鐘的時(shí)間內(nèi)制備完成。

 

 

Lysosyme、Concanavalin A以及Catalase的蛋白樣品按照?qǐng)?bào)道的方法進(jìn)行準(zhǔn)備，并完成了初步篩選。

 

按照不同蛋白得到的初步篩選條件，沉淀劑（PEG）和添加劑（如：propanediol）的濃度以對(duì)角線梯度的方式升高或是降低，從而進(jìn)一步優(yōu)化篩選條件。這樣的加樣方式可以在結(jié)晶板內(nèi)產(chǎn)生兩種不同試劑的濃度梯度，每個(gè)孔內(nèi)所需要添加的不同儲(chǔ)液量都會(huì)自動(dòng)依次分配。每種蛋白都會(huì)嘗試3種不同的pH條件，用dragonfly準(zhǔn)備9塊含有不同篩選條件的加樣板。

 

將這9塊篩選板放在水平搖床上混勻，用mosquito直接進(jìn)行蛋白溶液和篩選液的混合加樣（100 nL + 100 nL）。每天進(jìn)行培養(yǎng)觀察，三周后獲得了生長(zhǎng)出的晶體照片。

 

 

每塊優(yōu)化篩選板的準(zhǔn)備時(shí)間都不超過4.5分鐘。經(jīng)過7天得培養(yǎng)，每塊板中都可以觀察到3到15個(gè)孔內(nèi)有晶體生長(zhǎng)。

 

晶體成核和生長(zhǎng)的條件都通過調(diào)節(jié)溶液的濃度和pH值的方法進(jìn)行優(yōu)化。通過這種方式，獲得了大量的單個(gè)大體積的晶體。結(jié)構(gòu)解析和配體結(jié)合的研究過程中，往往會(huì)發(fā)生嚴(yán)重的晶體丟失的現(xiàn)象。大量晶體的獲得可以克服這個(gè)研究的瓶頸。

 

 

dragonfly已被證明可以快速有效地在96孔內(nèi)完成結(jié)晶條件的制備工作。與傳統(tǒng)的手工加樣相比，dragonfly制備優(yōu)化篩選條件的速度提高了至少3倍。

 

dragonfly采用的固相置換和非接觸式加樣技術(shù)確保了任意黏度液體的加樣準(zhǔn)確性，同時(shí)還杜絕了交叉污染的發(fā)生。儀器的設(shè)置和運(yùn)行十分簡(jiǎn)單便捷，不需要復(fù)雜的培訓(xùn)就可以讓不同的使用者獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。伴隨著實(shí)驗(yàn)的成功，用dragonfly配制優(yōu)化篩選條件已經(jīng)成為了MRC分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)行篩選的日常實(shí)驗(yàn)手段。使MRC的科學(xué)家可以快速、直接進(jìn)行大分子結(jié)晶條件優(yōu)化。

 

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