E玫瑰花環(huán)試驗的簡介及注意事項

實驗原理

動物T淋巴細(xì)胞表面具有結(jié)合異種動物紅細(xì)胞的受體，稱為E受體，在體外一定條件下，能與綿羊等動物的紅細(xì)胞結(jié)合，形成以T細(xì)胞為中心，紅細(xì)胞環(huán)繞在周圍，宛似一朵玫瑰花樣的花環(huán)，故取名為E玫瑰花環(huán)試驗(erythrocyte rosettes assay)或自然花環(huán)形成試驗。凡能與RBC形成E花環(huán)的淋巴細(xì)胞稱E花環(huán)形成細(xì)胞(Erosette forming cell，ERFC)。目前公認(rèn)綿羊紅細(xì)胞(SRBC)受體是人、騾、牛、山羊、豬等T淋巴細(xì)胞的特異標(biāo)志，ERFC就是T細(xì)胞。這種玫瑰花環(huán)形成不需任何物質(zhì)的刺激，故也稱自然玫瑰花環(huán)形成試驗。

在E玫瑰花環(huán)形成試驗中，當(dāng)一定比例的淋巴細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞混合后，不放置冰箱中孵育，早期離心、鏡檢，可見一部分T細(xì)胞與SRBC形成玫瑰花，稱之為“活性玫瑰花(active rosette)”，或稱為“早期玫瑰花(early rosette)”；而放置低溫4℃孵育后，形成的玫瑰花稱為總玫瑰花(total rosette)或晚期玫瑰花(late rosette)。

早期玫瑰花環(huán)形成的T淋巴細(xì)胞是對SRBC具有高度親和力的T細(xì)胞亞群，它與T細(xì)胞的體內(nèi)外功能活性密切相關(guān)，能更敏感地反映機體細(xì)胞免疫的水平和動態(tài)變化，是目前檢測細(xì)胞免疫水平最為簡便快速的方法之一。在總玫瑰花環(huán)試驗中，靜止期和活動期的T淋巴細(xì)胞，均能與不同數(shù)量的SRBC自發(fā)形成E花環(huán)，所得E花環(huán)的百分率和絕對數(shù)可代表被檢標(biāo)本中全部T淋巴細(xì)胞的百分率和總數(shù)。

實驗試劑

1. 抗凝劑200u/ml肝素生理鹽水溶液或38%檸檬酸鈉液。

2. 豚鼠抗凝血及家兔脫纖血或阿氏液保存的血液。

3. 淋巴細(xì)胞分層液比重為1077～1078(或1082～1084)。

4. 吸收滅活小牛血清小牛血清56℃ 30min滅活后，取2體積的小牛血清，加1體積壓積的家兔紅細(xì)胞，混勻，置37℃水浴30min，離心沉淀，吸取上清液，4℃冰箱保存。

5. 無鈣鎂Hanks液，pH值7.4。

6. 固定劑0.8%戊二醛。

7. 染液配制方法：

Ⅰ液瑞氏粉0.1g，甲醇60ml，研碎混勻。

Ⅱ液姬姆薩氏粉0.5g，純甘油33ml，甲醇33ml，先將姬姆薩氏粉溶于甘油中，并置60℃溫箱中(或水浴中保溫15～2h)，最后加甲醇即可。

使用時，分別將Ⅰ液和Ⅱ液用pH值6.4 PBS稀釋1倍。

實驗步驟

1. 1%家兔紅細(xì)胞懸液的制備  取家兔脫纖血或阿氏液保存的血液，以Hanks液洗三次，2000 r/min離心10min后，將壓積紅細(xì)胞用Hanks液配成1%懸液，含紅細(xì)胞數(shù)約為1×108/ml。

2. 豚鼠淋巴細(xì)胞的分離  取肝素抗凝血10ml，加等量Hanks液稀釋后，用毛細(xì)吸管沿管壁緩緩加入裝有淋巴細(xì)胞分層液的試管內(nèi)，使血液重疊于分層液上，用水平離心機以2，000 r/min離心30min。此時紅細(xì)胞沉降至最下層，上層為血漿，中層為分層液，血漿與分層液的界面有一白色狹帶為淋巴細(xì)胞和單個核細(xì)胞層。用毛細(xì)吸管吸取界面處的淋巴細(xì)胞與單個核細(xì)胞，置于離心管中，用Hanks液洗滌，1 000 r/min離心10min，反復(fù)1次，最后用Hanks液配成1×107個細(xì)胞/ml濃度的細(xì)胞懸液。必要時可用臺盼藍(lán)試驗進(jìn)行存活率檢查，應(yīng)在95%以上(活細(xì)胞不著色)。

3. 玫瑰花環(huán)形成試驗取上述淋巴細(xì)胞懸液0.3ml，加入1%家兔RBC 0.3ml及滅活小牛血清0.1ml，混勻，37℃水浴保溫25min，取出以500 r/min離心5min，棄上清，留少許液體，即可用此細(xì)胞液涂片或滴片進(jìn)行觀察，此時見到的玫瑰花環(huán)即為活性玫瑰花(Ea)。

如將此細(xì)胞液置4℃冰箱中作用2h(或過夜)取出后，再加入0.8%戊二醛2滴，輕輕旋轉(zhuǎn)試管，使沉淀的細(xì)胞重新懸浮，用毛細(xì)管輕輕混勻。此時觀察到的玫瑰花環(huán)為總玫瑰花(Et)。

4. 制片、鏡檢及結(jié)果

1) 濕片：取上述細(xì)胞液一滴加于事先鋪有瑞氏染液的玻片上，覆以蓋玻片，在高倍鏡下觀察，凡吸附4個或更多家兔紅細(xì)胞的單核細(xì)胞，為RE花環(huán)形成細(xì)胞，共計數(shù)200個細(xì)胞，算出百分率。

2) 干片：取培養(yǎng)物1滴于載玻片上，涂片、干燥，滴加甲醇固定5min，用pH值6.4 PBS沖洗，加Ⅰ液染4min，沖洗，再加Ⅱ液染4min，沖洗，待干，鏡檢。紅細(xì)胞染成紅色，淋巴細(xì)胞染成藍(lán)色�？梢娏馨图�(xì)胞周圍吸附有不同數(shù)量的紅細(xì)胞，呈玫瑰花環(huán)狀。

注意事項

1. 試驗用家兔紅細(xì)胞要新鮮，最好采血后當(dāng)天使用，但阿氏液保存的血液也不宜超過兩周。

2. 因為只有活淋巴細(xì)胞才能與家兔紅細(xì)胞形成玫瑰花環(huán)，因此試驗用血液要新鮮，隨采隨做。

3 .試驗中加入1%小牛血清，能增加玫瑰花環(huán)形成的穩(wěn)定性。用前須將血清以家兔RBC吸收，以去除對家兔紅細(xì)胞的天然抗體，否則抑制玫瑰花環(huán)的形成。

4. 分離豚鼠單個核細(xì)胞所用分層液的比重大小與細(xì)胞獲得率密切相關(guān)，一般以1082～1084最為適宜。

5. 淋巴細(xì)胞與家兔紅細(xì)胞比例以1∶40～1∶80較為適宜。

6. 用木瓜蛋白酶處理的家兔RBC作RE花環(huán)試驗，所得RE花環(huán)率有一定程度的提高。

7. 各淋巴細(xì)胞表面的紅細(xì)胞受體數(shù)量和對紅細(xì)胞親和力的程度有所不同，即使在同一實驗條件下，吸附紅細(xì)胞的數(shù)目也不同。試驗中可見到各種形式的花環(huán)，如環(huán)形花環(huán)，即整個淋巴細(xì)胞表面均吸附有紅細(xì)胞，一般在8個以上；不整形花環(huán)，即淋巴細(xì)胞表面有部分空缺，一般吸附4個細(xì)胞以上；有些淋巴細(xì)胞僅吸附1～3個紅細(xì)胞。為避免可能因紅細(xì)胞重疊在淋巴細(xì)胞上而造成誤差，故應(yīng)選擇吸附3個以上紅細(xì)胞為ERFC。