模式生物高通量多維表型研究方法概述

瀏覽次數(shù)：3493　發(fā)布日期：2015-9-9　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

摘要：

動(dòng)物個(gè)體內(nèi)，多數(shù)由基因突變與生物活性分子所引發(fā)的復(fù)雜生理應(yīng)答機(jī)制，無(wú)法使用細(xì)胞培養(yǎng)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)，而動(dòng)物水平研究卻進(jìn)展緩慢。本研究中，我們利用微米分辨率的高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)，結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實(shí)現(xiàn)了脊椎動(dòng)物的整體多維度掃描。系統(tǒng)以前所未有的速度與細(xì)節(jié)，在三個(gè)維度水平，自動(dòng)獲取了半透明斑馬魚(yú)幼體數(shù)以百計(jì)的獨(dú)特形態(tài)特征與復(fù)雜表型。通過(guò)聚集、量化多種表型特征，我們能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè)、分類(lèi)多個(gè)生物學(xué)進(jìn)程中的精細(xì)變化。我們將這種方法稱(chēng)為體內(nèi)多維表型研究。為了驗(yàn)證體內(nèi)多維表型研究方法的巨大作用，我們利用200個(gè)獨(dú)立形態(tài)檢測(cè)參數(shù)，對(duì)數(shù)十種致畸劑（可引起軟骨形成異常）效應(yīng)進(jìn)行分析，結(jié)合致畸劑的已知機(jī)制，識(shí)別其相似和不同之處。

背景：

針對(duì)多種因素引起的形態(tài)學(xué)變化特征，進(jìn)行高通量篩選，是現(xiàn)代生物學(xué)研究與藥物篩選中必不可少的。當(dāng)前研究中，在細(xì)胞學(xué)水平高通量篩選（HTS）獲得的有效藥物，在進(jìn)一步動(dòng)物水平研究和臨床研究時(shí)，結(jié)果不盡如人意。即使是最復(fù)雜的體外模型，也無(wú)法完全展現(xiàn)器官形成的復(fù)雜程度與構(gòu)成等信息。為了克服體外模型在藥物篩選等應(yīng)用中的不足，越來(lái)越多的化學(xué)藥物使用斑馬魚(yú)(zebrafish、Danio rerio)個(gè)體進(jìn)行篩選研究。斑馬魚(yú)幼體是目前廣泛應(yīng)用于藥物篩選的脊椎動(dòng)物模型。針對(duì)斑馬魚(yú)的大規(guī)�；蛩胶Y選工作已經(jīng)開(kāi)展了數(shù)十年，但由于所讀取的結(jié)果往往無(wú)法定量說(shuō)明或局限在有限的參數(shù)記錄，因此需要更完善的解決方案。

為了將數(shù)百種表型的改變進(jìn)行定量記錄分析，并實(shí)現(xiàn)高內(nèi)涵篩選（HCS），我們應(yīng)用高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)（high-throughput optical projection tomography system，OPT），該系統(tǒng)結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），配合特殊的圖像處理算法，能夠兼容各種顯微鏡，從而獲得微米級(jí)分辨率的3D器官或復(fù)雜形態(tài)學(xué)特征參數(shù)。這一技術(shù)幫助我們從大量動(dòng)物樣本中快速獲得數(shù)百種獨(dú)特形態(tài)特征和復(fù)雜表型的信息。

Nature Communications 4, February 12, 2013, Article number:1467, doi:10.1038/ncomms2475

Carlos Pardo-Martin, Amin Allalou, Jaime Medina, Peter M. Eimon, Carolina Wählby Mehmet Fatih Yanik
1 Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology (MIT)

2 Division of Health Sciences and Technology, MIT,

3 School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University

4 Centre for Image Analysis, Science for Life Laboratory, Uppsala University, Sweden.

5 Imaging Platform, Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology and Harvard

6 Department of Biological Engineering, MIT

結(jié)果分析：

1.Union Biometrica BioSorter^®Flow Cytometry（新式高通量分選OPT系統(tǒng)）：射流系統(tǒng)與顯微觀察系統(tǒng)組。BioSorte^®不需要對(duì)斑馬魚(yú)樣本進(jìn)行預(yù)處理，避免了常規(guī)OPT技術(shù)中最耗費(fèi)時(shí)間的步驟。

2.圖像矯正過(guò)程：通過(guò)多步圖像軟件矯正，獲得準(zhǔn)確的層析重建圖像。

3.顱面畸形三維重建與評(píng)估：每條斑馬魚(yú)幼體，記錄高達(dá)320幀的圖像，通過(guò)三維重構(gòu)技術(shù)，形象化展示了斑馬魚(yú)幼體軟骨復(fù)雜表型。圖像顯示的層析效果圖充分顯示了三種不同藥物處理后的5dpf斑馬魚(yú)幼體的顱面骨骼變化。三種藥物是：retinoic acid（視黃酸）、cyclopamine（環(huán)巴胺）和flusilazole（氟硅唑）。

4.藥物篩選研究實(shí)例：不同濃度環(huán)巴胺藥物對(duì)三種軟骨生長(zhǎng)的影響

5.體內(nèi)多維度表型分析：為了全面定量斑馬魚(yú)幼體表型變異情況，研究者計(jì)算了202個(gè)獨(dú)立的指標(biāo)，用于重建3D表型圖。這些參數(shù)包含了長(zhǎng)度、3D方向、表面積及各種骨骼體積等等。

6.大量斑馬魚(yú)幼體表型變化陣列分布：每一行代表了一種藥物作用斑馬魚(yú)幼體的影響。檢測(cè)結(jié)果以顏色表示，紅色代表幼體個(gè)體表型相對(duì)未處理幼體表達(dá)下降，綠色代表表達(dá)增長(zhǎng)。

結(jié)論：

傳統(tǒng)藥物高內(nèi)涵篩選（HCS）技術(shù)局限在簡(jiǎn)化的生物模型，如無(wú)線增殖的細(xì)胞系等，而在使用原代細(xì)胞、in vivo動(dòng)物模型等進(jìn)行HCS研究時(shí)，傳統(tǒng)技術(shù)面臨眾多的問(wèn)題。本研究利用微米分辨率的高通量光學(xué)投影層析成像系統(tǒng)，結(jié)合高效的大顆粒流式分選系統(tǒng)（Union Biometrica），實(shí)現(xiàn)了脊椎動(dòng)物的整體多維度掃描。本技術(shù)能夠提供脊椎動(dòng)物器官和組織的3D重建圖像，針對(duì)斑馬魚(yú)幼體的研究，本技術(shù)通過(guò)能夠?yàn)檠芯空咛峁颖緜€(gè)體的多種表型特征，為動(dòng)物個(gè)體水平實(shí)現(xiàn)藥物高內(nèi)涵篩選（HCS）提供了可行的技術(shù)平臺(tái)。

相關(guān)：

Union Biometrica 流式分選系統(tǒng)：是基于流式細(xì)胞技術(shù)開(kāi)發(fā)的，與普通的流式細(xì)胞技術(shù)相比有非常很重要的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：

COPAS VAST BioImager™ 斑馬魚(yú)自動(dòng)分選系統(tǒng),COPAS Platform是基于流式細(xì)胞技術(shù)開(kāi)發(fā)的，但與普通的流式細(xì)胞技術(shù)相比有兩個(gè)很重要的優(yōu)勢(shì)。這是市面上唯一的能夠分選20-1500um生物微粒的全自動(dòng)，高通量分選系統(tǒng)。他的管路直徑大，可以用來(lái)分選體積較大的生物微粒，比如：線蟲(chóng)、果蠅、斑馬魚(yú)、大腸桿菌、擬南芥種子。

模式生物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生活周期短、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、基因組小等特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。模式生物作為材料不僅能回答生命科學(xué)研究中最基本的生物學(xué)問(wèn)題，對(duì)人類(lèi)一些疾病的治療也有借鑒意義。常見(jiàn)的模式生物有有真菌中的酵母，原核生物中的大腸桿菌，低等無(wú)脊椎動(dòng)物中的線蟲(chóng)，昆蟲(chóng)綱的果蠅，魚(yú)綱的斑馬魚(yú)，植物中的擬南芥等。

這些模式生物的分選在生命科學(xué)研究中有著非常廣泛的應(yīng)用，但是由于這些對(duì)象體積太大，普通流式細(xì)胞儀難以對(duì)其進(jìn)行分選，而手工鏡下分選耗時(shí)耗力、效率低下、準(zhǔn)確性難以保證，因此一種自動(dòng)化大體積微粒分選系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生——COPAS多參數(shù)生物微粒分析與分選系統(tǒng)。

Union Biometrica流式分選系統(tǒng)進(jìn)行斑馬魚(yú)研究的文獻(xiàn)：

1.Presenting VAST BioImager™: A new modular, expandable platform to automate the orientation of 2-7 day old zebrafish larvae for imaging

2.Development and Validation of an Automated High-Throughput System for Zebrafish In Vivo Screenings

3.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing

4.Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing

5.A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression

6.Zebrafish high throughput screening using robotic injection technology

7.High-throughput in vivo vertebrate screening.

8.Zebrafish High-Throughput Screening of Innate Immune Responses.

9.A High-Throughput Assay To Measure Whole Body Metabolic Rate Using Zebrafish Larvae.

10.A Whole-Animal Microplate Assay for Metabolic Rate Using Zebrafish

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