多克隆抗體的制備步驟

實驗試劑

生理鹽水（或PBS）

弗氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant，F(xiàn)CA）

弗氏不完全佐劑（Freund’s incomplete adjuvant， FIA）

二甲苯，酒精棉，脫脂棉，2% NaN3

實驗設(shè)備

剪刀（剪兔毛用）一把、彎頭眼科手術(shù)鑷子（游離血管用）一把、直頭眼科手術(shù)剪（剪血管用）一把，手術(shù)刀架，手術(shù)刀片，注射器（1ml、10ml，25ml）附針頭，兔子固定架，滅菌三角燒瓶（200ml）或平皿（直徑18cm）、彎頭止血鉗四把，直頭止血鉗兩把，手術(shù)縫合線，塑料放血管，紗布等。

實驗材料

1. 免疫原：蛋白或KLH偶聯(lián)的多肽。每次免疫100-200μg免疫原。

2. 兔子的選擇，兔子的重量應(yīng)在四斤以上，兩耳光滑，明顯可見耳靜、動脈，健康。

實驗步驟

1. 免疫

用生理鹽水稀釋免疫原，然后與相應(yīng)的佐劑進行1:1混合�？乖�和佐劑完全混合形成穩(wěn)定的乳劑，將該乳劑在兔子雙肩周圍的皮膚下進行皮下注射和后大腿進行肌肉注射。每個區(qū)域大約用1/4的免疫原。這樣免疫原可以持久存在從而提高免疫應(yīng)答。

注：

抗原注射以前需要收集一些正常血清，已備檢測抗體時作為陰性對照。待兔子在新環(huán)境中穩(wěn)定，大概需要四天左右時間，可以進行耳動脈取血。取血量約5ml足矣。

免疫用的抗原必須純化，否則影響抗體的質(zhì)量�？乖�經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射。將抗原液與佐劑等比例混合后，置于混合器上使之劇烈振蕩使抗原充分乳化，乳化過程比較費時、費力，但若乳化不充分，會影響免疫的效果，振蕩后，1000rpm離心一分鐘，如水相和油相不分層即可注射。首次免疫用FCA，以后都用FIA。

免疫方法可采用背部多點注射法。即于家兔脊柱兩旁選4-6點皮下注射，每點注0.1ml，間隔2周后再于上述部位選不同點注射（不要選擇臨近位點，否則潰瘍愈合不好）。每次免疫的抗原量約100μg。免疫次數(shù)在四五次即可，抗原用量大可以減少次數(shù)。

2. 取血

免疫一周后，可以耳動脈取血檢測抗體效價。因為起初幾次免疫產(chǎn)生的抗體的效價比較低，頭兩次取血，夠檢測用即可。在三次免疫后，可以獲得較高效價的抗體，每次取血量可以在40ml，不要取太多，否則會造成兔子貧血。

前幾次取血用19號針頭對兔子進行耳動脈取血，室溫過夜析出血清。

最后一次取血可以采用頸動脈放血，具體操作如下：

  1) 家兔仰臥于兔架上固定頭部，用紗布固定四肢。頭部略放低以暴露頸部。剃毛并消毒皮膚。

  2) 沿頸部中線用手術(shù)刀切開皮膚約10cm，分離皮下結(jié)締組織，直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突�。ㄐ⌒牟僮�，如碰到小血管出血，可用止血鉗止血）。

  3) 用直頭止血鉗分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織，暴露出頸總動脈后用彎頭眼科鑷使之游離，剝離神經(jīng)和結(jié)締組織。

  4) 于動脈下套入兩根黑絲線，分別置于遠心及近心端。結(jié)扎遠心端的絲線。近心端的動脈用血管夾夾住。

  5) 用小拇指墊在血管下，用尖頭眼科手術(shù)剪在兩根絲線間的動脈璧上剪一小口（勿剪斷），插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上，以防放血管滑脫。

  6) 松開止血鉗，使血液流入容器中。一般一只家兔可放血100-120ml。

3. 血清的分離

如果用三角瓶或平皿盛血，將器皿傾斜放置于37oC烘箱2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上用吸管吸取血清。如果用離心管收集，37oC烘箱放置2hr，轉(zhuǎn)移到4oC沉淀過夜，第二天早上離心，10000RCF，10分鐘。在血清中加入NaN3至終濃度0.02%，分裝后-20oC保存。