免疫細胞治療DC-CIK細胞的制備方法及SAFIRE功能性人CD3單抗

摘要

SAFIRE是“不含疊氮鈉，極低內(nèi)毒素 Sodium Azide Free Immensely Reduced Endotoxin”的簡稱。生產(chǎn)中不添加任何載體，內(nèi)毒素水平低至0.01EU/ug以下，更加適用于體內(nèi)及體外的功能學(xué)實驗研究。

BioGems SAFIRE功能性抗體介紹：

BioGems世界頂級抗體研發(fā)制造公司/品牌

SAFIRE功能性抗體是BioGems流式產(chǎn)品的一條重要的產(chǎn)品線，可用于激活、阻斷和中和實驗等，SAFIRE是“Sodium Azide Free Immensely Reduced Endotoxin”的簡稱，即“不含疊氮鈉，極低內(nèi)毒素”。生產(chǎn)過程中沒有添加任何載體，內(nèi)毒素水平低至0.01EU/ug以下，更加適用于體內(nèi)及體外的功能學(xué)實驗研究。其中BIoGems 05121-25-500 SAFIRE 功能性CD3單抗就是BioGems品牌的具有顛覆性的品質(zhì)與價格的典型代表。

疊氮鈉，及NaN3，屬于防腐劑，能阻斷線粒體的電轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，對大多數(shù)有機體有毒性。在體內(nèi)，疊氮化物和氰化物類似，對細胞色素氧化酶和其它酶有抑制作用，并能使體內(nèi)氧合血紅蛋白的形成受阻，有顯著的降壓作，且對眼睛和皮膚有一定和刺激性。

內(nèi)毒素在體內(nèi)也可引起一系列反應(yīng)，如各種炎癥反應(yīng)、低血壓、白細胞數(shù)異常、血管內(nèi)血凝結(jié)、休克甚至致死等、在體外，內(nèi)毒素可以與CD14及其他一些受體反應(yīng)、誘導(dǎo)單核細胞及巨噬細胞釋放細胞因子，觸發(fā)補體系統(tǒng)，促進B細胞分裂等。

兩者會帶來不可控的影響，降低實驗的特異性，并干擾結(jié)果的準確性。而BioGems的SAFIRE系列功能性抗體不含疊氮鈉，內(nèi)毒素水平極低，完全可以滿足體內(nèi)及體外功能學(xué)實驗需要。

BioGems目前已有SAFIRE功能性抗體132咱，其中人49種，小鼠89種，鼠8種，且產(chǎn)品種類在不斷增加。

Catalogue Number :05121-25

Description

The OKT3 monoclonal antibody specifically reacts with the ε chain of the CD3/T lymphocyte antigen receptor complex. The CD3 complex contains γ, δ, and ε chains, and it is part of the TCR complex, expressed by all mature T lymphocytes and by the thymocyte lineage. CD3 enhances the antigen recognition by signal transduction.

The OKT3 antibody is an immunosuppressive, which has proven to be an effective therapeutic agent in liver, heart, and renal allograft rejection.
Additional Information

Clone：OKT3
Format：SAFIRE Purified
Applications：FC, FA, IHC
Reactivity：Human
Isotype：Mouse IgG2a, kappa
Research Interest：Adaptive Immunity
Cell Type：  NK and NKT Cells, T Cells, Treg cells, Th17 cells

DC-CIK細胞的制備方法

背景

CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞”。CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子（包括IFN-y,IL-2等）的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞（自然殺傷細胞）的非MHC（主要組織相容性抗原）限制性腫瘤殺傷能力。CIK細胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。

DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M.Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞（Antigen Presenting Cells,APC）。已證實，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細胞（Naïve T cells）增殖的APC，而其它APC（如單核巨噬細胞，B細胞等）僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC是機體適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。

DC-CIK即DC和CIK細胞在體外共培養(yǎng)，然后回輸給患者。嚴格的說，最終的效應(yīng)細胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細胞毒活性也得以增強，因些DC-CIK較單獨的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性的非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨床和科研。

培養(yǎng)原理

Preparation：The product should be stored undiluted at 4°C. Do not freeze. The monoclonal antibody was purified utilizing affinity chromatography. The endotoxin level is determined by LAL test to be less than 0.01 EU/µg of the protein.
Formulation：Phosphate-buffered aqueous solution, ph7.2.
 

1.DC培養(yǎng)用細胞因子:

GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)：

GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成，并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發(fā)育的功能。GM-CSF是最早被鑒定出來對于DC有作用的細胞因子之一。

GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進DC的存活。

IL-4在由單核細胞誘導(dǎo)成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4還有降低細胞表面表達CD14分子的能力。CD14表達水平的降低是單核細胞分化為DC的重要標志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC（immature DC）,此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I 類、II 類分子和B7家庭分子(CD80，CD86等)，但不表達CD14.

TNF-α (腫瘤壞死因子-α)
TNF-α可下調(diào)未成熟DC 的巨胞飲作用和表面Fc 受體的表達，使細胞內(nèi)MHC II 類
分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細胞表面MHC I 類、II 類分子和B7 家
族分子(CD80, CD86 等)的表達，使未成熟DC 分化為成熟DC(mature DC)，此時DC 的
抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強的激活T 細胞。

2．CIK 培養(yǎng)用細胞因子和抗體：
CD3 激發(fā)型單抗：
T 細胞活化的第一信號來自于T 細胞表面的受體，即T 細胞抗原受體(T cell antigen
receptor, TCR)與APC 提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T 細胞對抗原的特異性識別。
TCR 是由2 條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T 細胞表面，其與CD3 分子通過非共價鍵
結(jié)合，形成TCR/CD3 復(fù)合體。TCR 識別特異性抗原后會引起CD3 和T 細胞表面的輔助
受體CD4 或CD8 分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn
和ZAP-70 等)，促使CD3 分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進一步
磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或MAP 激
酶途徑等)，最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T 細胞增殖和活
化的靶基因(如IL-2 和IFN-γ等)，引起基因的表達和轉(zhuǎn)錄，T 細胞因而由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)為
增殖和活化狀態(tài)。

由上可見，CD3 分子在T 細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3 激發(fā)型單抗與T 細胞表面CD3 分子特異性結(jié)合后，可引起CD3 分子胞漿區(qū)ITAM 基序中酪氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致T 細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T 細胞增殖和活化。也就是說，CD3 激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3 復(fù)合物的識別和激活過程，從而引起T 細胞的增殖與活化，因此是CIK 細胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3 激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3
的CD3 激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T 細胞的增殖，而其它克隆號的CD3 激發(fā)型單抗
僅能刺激一部分人的T 細胞。因此，在進行CIK 培養(yǎng)時，最好選用OKT-3 克隆，以保
證每個患者的T 細胞均能被激活。

IL-2 (白細胞介素-2)
IL-2 最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T 細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T 細胞
增殖最重要的細胞因子。IL-2 既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T
細胞表面的IL-2 受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T 細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。
此外，IL-2 還可刺激NK 細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK 細胞培養(yǎng)中須添加
IL-2，以促進T 細胞的增殖與活化。

IFN-γ (干擾素-γ)
IFN-γ 具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促
增殖反應(yīng)的敏感度和強度。在誘導(dǎo)CIK細胞形成的過程中加入IFN- γ ，可降低IL-2的用量。
研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN- γ，培養(yǎng)24后再
加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。

IL-1α(白細胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型
CD3 單抗合用時，可以明顯提高CIK 的細胞毒作用。

細胞制備
1．外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)。
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2 次，獲得純度在90%以上的PBMC，細胞數(shù)量需達到 1-3 x108。

2． (可選步驟) 腫瘤抗原的制備
用于負載DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。用TSA 或TAA 負載的DC 具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全細胞抗原負載DC 可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的TSA 或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC 可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的細胞毒T 淋巴細胞(CTL)克隆，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的有效殺傷。腫瘤細胞全抗原負載DC 的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。反復(fù)凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1 手術(shù)切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2 無菌生理鹽水洗3 次；
2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640 培養(yǎng)基，充分研磨；
2.4 200 目無菌網(wǎng)過濾后收集單細胞懸液；
2.5 用RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml 無菌凍存管中；
2.6 將凍存管浸入液氮中速凍，10 min 后取出，再迅速放入37℃水浴中解凍10 min。
反復(fù)3-5 次；
注：也可以-80℃/37℃反復(fù)凍融3-5 次。
2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
2.8 收取上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
2.9  -80℃保存?zhèn)溆谩?/FONT>