實驗室如何檢測及解決PCR污染的方法
生物實驗，大多數(shù)實驗檢測都是微觀的，基于細胞，分子，蛋白水平，而這些微觀樣本對外界環(huán)境的影響敏感，比如溫度、ph值、酶解、損傷等，在我們盡力呵護樣本的生存環(huán)境的同時，污染也是需要注意的頭等大事，要堅決避免環(huán)境中的“雜質(zhì)”的亂入，包括樣本污染，試劑儀器交叉污染、產(chǎn)物氣溶膠污染等對實驗結(jié)果的影響。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，防不勝防，假陽性結(jié)果讓無數(shù)生物學(xué)子抓狂和崩潰。
小編今天就來扒一扒生物實驗室污染之PCR實驗污染你不知道的事。
在眾多的生物實驗室，分子生物學(xué)檢測方法如PCR因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，不過正是由于它靈敏度極高，極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果的假陽性，所以對環(huán)境污染的控制也極為嚴格。面對眾多的污染源，比如樣本交叉污染、試劑儀器交叉污染、克隆質(zhì)粒污染、PCR擴增產(chǎn)物污染、還有極容易忽視的氣溶膠污染，氣溶膠是由固體或液體小質(zhì)點分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系，在空氣與液體面摩擦?xí)r，比如在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個非常重要而被忽視的污染源。
雖然這些污染對PCR實驗結(jié)果的影響已經(jīng)受到了廣泛重視，多數(shù)實驗室對污染控制都采取了各種辦法，比如定期大掃除清理、劃分操作區(qū)域、試劑分裝、操作謹慎、重復(fù)實驗、多角度驗證結(jié)果。但是微量的核酸片段就能被擴增，所以對污染物的控制不僅僅是做到這些就能夠杜絕和避免的，關(guān)鍵是需要從源頭控制。目前多數(shù)生物試驗室，分子實驗每天都在大規(guī)模進行，污染源已經(jīng)無處不在，特異性的，非特異性的，同源的，非同源的，廣泛分布在樣本容器、實驗室臺面，試劑溶液中、儀器表面內(nèi)管附著等等，你以為普通的清理就能解決這些污染源嗎？必須是不行的，實驗室大拿們都為了清除這些污染源研究出好多種方法，整理跟大家共享。
|
傳統(tǒng)方式 |
原理 |
優(yōu)勢 |
不足 |
|
酒精擦拭 |
將核酸沉淀，擦拭后保證污染表面污染得到一定程度緩解 |
簡單、方便、成本低 |
不徹底（核酸片段本身沒有變化，仍然存在導(dǎo)致氣溶膠污染的可能性）、細小孔徑器材無法清除 |
|
修飾 |
標記遺傳物質(zhì)，阻止聚合酶與核酸的結(jié)合，從而抑制DNA擴增 |
效果相對好 |
反應(yīng)可逆、成本高、試劑可能具有不安全影響 |
|
酶解 |
酶可將長鏈的核酸分子降解成小片段 |
速度快，效果相對較好 |
降解的核酸中仍有大片段存在，具有完整的遺傳信息，可通過PCR擴增出完整的片段、成本高 |
|
高壓變性 |
高壓可將核酸降解成20～30bp的小片段 |
徹底，成本低 |
僅適用于耐高壓材料，更無法應(yīng)用實驗操作臺和大型的實驗設(shè)備 |
|
紫外照射 |
PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會形成二聚體，延伸終止 |
方便，范圍廣，成本低 |
僅對500bp以上長片段有效，對短片段效果不大，且并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體，且UV照射還可使二聚體斷裂 |
縱然有這么多解決核酸污染源的辦法，但是大多數(shù)實驗室卻由于使用不方便、操作復(fù)雜、成本高、危害大而沒有持續(xù)采用，實驗室累積的污染也就越來越多，有些實驗者甚至在ddH2O中擴增出了條帶，結(jié)果可重復(fù)性差、投稿文章被質(zhì)疑，不得不重新實驗，當(dāng)然在實驗之前，必須要徹底清除這些污染源，這么嚴重的污染如何高效的清除，是一個迫在眉睫的問題。目前國外學(xué)者經(jīng)過不斷研發(fā)拓展，有一款清除劑已經(jīng)問世，并得到了Nature Methods的推薦，此款清除劑純綠色配方，能夠?qū)⑽廴驹吹暮怂崞螐氐捉到獬珊塑账釣閱挝坏臉O小片段，此過程不可逆，避免了污染重復(fù)的可能性，使用方便，使用與所有臺面，儀器擦拭，小部件浸泡等，無污染，無腐蝕性，對人體無危害。簡直是廣大核酸污染受害者的福音啊。
小編當(dāng)初在實驗室就遇到了PCR污染，可苦于當(dāng)時不知道世上竟有如此神器，實驗反反復(fù)復(fù)折騰了好多次才得到圓滿結(jié)果，好東西就要分享，在此推薦給大家，希望對各位看官有所幫助。
