分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)（二）--反轉(zhuǎn)錄篇

——反轉(zhuǎn)錄篇——

反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse Transcription, RT-PCR）又稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR，是指擴(kuò)增mRNA的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA為模板，用PCR方法加以擴(kuò)增。

（一）逆轉(zhuǎn)錄酶的種類

AMV：有較強(qiáng)的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適42℃。在高反應(yīng)溫度時(shí)可消除mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的阻礙，然而高水平的RNA酶H的活性既抑制cDNA產(chǎn)生也限制其長(zhǎng)度。

MMLV：有強(qiáng)的聚合酶活性，而RNA酶H活性較弱。較弱的RNA酶H活性對(duì)獲得2-3kb的mRNA的全長(zhǎng)cDNA有很大好處。最適37℃。

Super RNaseH- Reverse Transcriptase：MMLV反轉(zhuǎn)錄酶的RNase H-突變體，它能將更大部分的RNA轉(zhuǎn)換成cDNA，這一特性允許從含二級(jí)結(jié)構(gòu)的、低溫反轉(zhuǎn)錄很困難的模板合成較長(zhǎng)的cDNA，最適42℃。（商品名為SuperScript和SuperScriptⅡ）

GoScript Reverse Transcriptase：專為 qPCR 而設(shè)計(jì)，利用 M-MLV 和先進(jìn)的緩沖液技術(shù)獲得均衡穩(wěn)定和可靠的 cDNA 合成結(jié)果，適合各種大小范圍的低豐度和高豐度的轉(zhuǎn)錄子，即使存在抑制劑也不受影響。

根據(jù)很多實(shí)驗(yàn)人員的經(jīng)驗(yàn)反映，Promega的反轉(zhuǎn)錄酶效果杠杠滴，本人用過(guò)TaKaRa的，也是不錯(cuò)噠！大家可以根據(jù)自身情況進(jìn)行選擇。

（二）引物的選擇

反轉(zhuǎn)錄引物有多種選擇，Oligo(dT)、隨機(jī)引物、基因特異性引物（GSP）等。

用來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的引物及其常用的推薦濃度如下表所示：

（表格引用Promega公司的 GoScript 反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)操作方法說(shuō)明書）

（三）優(yōu)化及注意事項(xiàng)

1. 逆轉(zhuǎn)錄PCR時(shí)，提取RNA是關(guān)鍵，需分離高質(zhì)量RNA（純度和完整性）。

2. 整個(gè)操作過(guò)程需使用祛RNA酶耗槍頭及EP管。

3. 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中要謹(jǐn)防RNA酶的污染，加入RNA酶抑制劑。

4. 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對(duì)照。

5. 使用無(wú)RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶

6. 提高逆轉(zhuǎn)錄酶保溫溫度

7. 減少基因組DNA污染

8. 對(duì)于反轉(zhuǎn)錄酶活性來(lái)說(shuō)，二價(jià)陽(yáng)離子是必需的。 對(duì)于大多數(shù)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，建議加入氯化鎂至鎂離子終濃度為2.5 mM 以得到最佳結(jié)果，可在1.5到5mM范圍內(nèi)調(diào)整優(yōu)化。對(duì)于長(zhǎng)片段 RNA 的反轉(zhuǎn)錄，可以降低鎂離子濃度以提高延伸的完整性；短片段RNA的反轉(zhuǎn)錄，可以提高鎂離子濃度以提高反轉(zhuǎn)錄的效率。

下一期的熒光定量PCR篇，敬請(qǐng)期待！