分子生物學(xué)相關(guān)實驗步驟及注意事項（三）qPCR篇
——熒光定量PCR篇——
實時熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料，每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。
一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段, 熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。
（一）熒光閾值和CT值
熒光閾值（threshold）是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般熒光域值的缺�。J(rèn)）設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
CT值是指PCR擴(kuò)增過程中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
CT值與起始模板的關(guān)系：研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，公式如下：Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)
n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量。
利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。
（二）熒光探針和熒光染料
熒光定量檢測根據(jù)所使用的標(biāo)記物不同可分為熒光探針和熒光染料。
SYBR Green I是熒光定量PCR最常用的DNA結(jié)合染料，與雙鏈DNA非特異性結(jié)合。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但與雙鏈 DNA 結(jié)合后，其熒光大大增強。SYBR Green I 用于qPCR無需探針，設(shè)計的程序通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈 DNA 熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以鑒定有無PCR雜帶、引物二聚體等。但是SYBR Green I 無模板特異性，因此會引起假陽性而影響定量的精確性。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它設(shè)計為與目標(biāo)序列上游引物和下游引物之間的序列配對，特異性更高。
（三）qPCR注意事項
1. 用于qPCR反應(yīng)的RNA應(yīng)避免DNA的污染，RNA提取和反轉(zhuǎn)過程中應(yīng)小心謹(jǐn)慎。
2. 操作過程中避光，冰上操作。
3. cDNA模板避免反復(fù)凍融，否則會引起模板的降解。
4. 模板量不足或降解將導(dǎo)致CT值出現(xiàn)過晚或者不出現(xiàn)。對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起。
5. 加入模板時應(yīng)先進(jìn)行適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，提高擴(kuò)增效率。但模板濃度過低導(dǎo)致重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。
6. 引物設(shè)計時，擴(kuò)增片段不宜太長，一般在80-300bp均可；退火溫度要高，一般要在 60℃以上。并且要特別注意避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增的存在。
7. 體系中引物濃度過高或者引物二聚體均會引起溶解曲線不止出現(xiàn)一個主峰。
8. 設(shè)置陰性對照，防止水和mix被污染。
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