【銳賽小課題】染色體分離實(shí)驗(yàn)

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一、聚胺法分離染色質(zhì)
試劑、試劑盒：秋水仙胺、聚胺緩沖液
實(shí)驗(yàn)步驟：
有絲分裂中細(xì)胞的同步化
1. 37℃，用合適的含有 FCS，抗生素和其他必要成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。
2. 收集有絲分裂細(xì)胞前 10~16 小時(shí)在培養(yǎng)基中以 0.06 μg/ml 的濃度加入秋水仙胺。
收獲細(xì)胞并在聚胺緩沖液中裂解
3. 收獲細(xì)胞。
對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（500 ml 培養(yǎng)基），室溫 1500 g 離心 5 分鐘收獲細(xì)胞。在室溫用聚胺緩沖液清洗三次所得到的沉淀，1500 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。
聚胺緩沖液：
15 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
0.2 mmol/L 精胺
0.5 mmol/L 精咪
2 mmol/L EDTA
80 mmoI/L KCl
0.1 mmol/L PMSF（臨用前從用 100% 乙醇制備的 1 mmol/L 的貯存液中加入）
4. 細(xì)胞用 20 ml 冰冷的含 0.1％ 毛地黃皂苷的聚胺緩沖液重懸浮。
5. 用 Dounce 勻漿器和 B 研棒進(jìn)行 10 次溫和勻漿裂解細(xì)胞（過于劇烈的勻漿會(huì)導(dǎo)致染色體明顯損傷）。另外也可以將懸液溫和地吸到一塑料注射器中，然后推動(dòng)便其通過 25 號(hào)針頭（應(yīng)避免溶液起泡沫）。
6. 細(xì)胞裂解后，取出少量裂解液觀察染色質(zhì)釋放情況。在有一滴用來進(jìn)行 DNA 染色的 2 μg/ml Hoechst 33258 的分離緩沖液溶液的載玻片上，滴一滴裂解懸液。用熒光顯微鏡觀察染色質(zhì)。
7. 用 JS-13 ( Beckman)，HB-4 (Sorvall)，2150 (Herace) 或相似的懸桶式轉(zhuǎn)頭在 250 g 離心 1 分鐘沉淀裂解液去除碎片。
8. 取出含有染色體的上清，3000 g 離心 15 分鐘。
9. 將含有染色體的沉淀重懸浮于 5~10 ml 的聚胺緩沖液中。制備的染色體可以在 4℃ 保存。保存 2~4 個(gè)星期后觀察不到形態(tài)的變化；但對(duì)于特殊目的的研究（例如酶活性，不穩(wěn)定蛋白），得到的染色體應(yīng)立即使用。

二、水相法分離染色質(zhì)
試劑、試劑盒：水相裂解緩沖液
儀器、耗材：離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)步驟：
像聚胺法的第 1、2 步中講的那樣誘導(dǎo)懸浮或單層培養(yǎng)細(xì)胞的中期阻遏狀態(tài)。
2. 細(xì)胞在 4℃，1000 g 離心 10 分鐘然后重懸浮，典型的制備量為 10 ml 新鮮培養(yǎng)基含 108 個(gè)細(xì)胞。
3. 將濃的細(xì)胞懸液在冰上放置至少 30 分鐘冷卻以幫助有絲分裂復(fù)合物的完全解離。
4. 4℃ 1000 r/min 離心 10 分鐘沉淀細(xì)胞。
5. 沉淀用 10 ml 75 mmol/L 的 KCI 重懸浮，4℃ 孵育 20 分鐘進(jìn)行低滲溶脹。
6. 4℃ 1000 r/min 離心溶脹細(xì)胞。
7. 將細(xì)胞重懸浮于 10 ml 的水相裂解緩沖液中，溫和攬拌，冰上放置 5 分鐘。
水相裂解緩沖液：
10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
120 mmol/L KCl
20 mmol/L NaCl
0.1 % Triton X-100
含 2 mmol/L CaCl2 的 0.1 mmol/L PMSF
8. 將懸液溫和地反復(fù)通過一 25 號(hào)皮下注射針頭大約 10 次或用 Dounce 勻漿器破碎法使細(xì)胞完全裂解（避免產(chǎn)生氣泡）。
9. 將破碎的細(xì)胞在 4℃ 400 g 離心 3 分鐘去除細(xì)胞核，上清移至一干凈的離心管中。
10. 4℃ 3000 g 離心上清 15 分鐘以濃縮染色體。 

三、用己二醇法分離中期染色質(zhì)
試劑、試劑盒：己二醇緩沖液
儀器、耗材：Dounce 勻漿器
實(shí)驗(yàn)步驟：
按聚胺法第 1 和 2 步中所述誘導(dǎo) 500 ml 懸浮或單層培養(yǎng)細(xì)胞為中期阻遏狀態(tài)。
2. 細(xì)胞在 4℃ 1000 r/min 離心 10 分鐘，用 10 ml 培養(yǎng)基重懸浮。
3. 將重懸浮的細(xì)胞冷卻至 4℃ 放置 20 分鐘。
4. 細(xì)胞在 4℃ 1000 r/min 離心 4 分鐘，取出培養(yǎng)基。
5. 在 4℃ 用己二醇緩沖液清洗細(xì)胞，按第 4 步進(jìn)行離心。
己二醇緩沖液：
1.0 mol/L 己二醇（2-甲基-2，4 戊二醇）
0.5 mmol/L CaCl2
0.1 mmol/L PIPES，pH 6.5
6. 用 10 ml 冷己二醇緩沖液溫和地重懸浮細(xì)胞，37℃ 孵育 10 分鐘。
7. 緩慢地將細(xì)胞懸液通過 25 號(hào)針頭注射器或用 Dounce 勻漿器勻漿 10 次（避免產(chǎn)生過多氣泡）。
8. 染色體懸液粗品用 JA-20 轉(zhuǎn)頭（Beclanan J-21 離心機(jī)）在 4℃ 5000 r/min 離心 15 分鐘進(jìn)行濃縮。 

四、蔗糖梯度純化法
實(shí)驗(yàn)材料：染色質(zhì)粗品
試劑、試劑盒：聚碳酸酯離心管
儀器、耗材：Dounce 勻漿器
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 準(zhǔn)備兩種 18ml，濃度分別為 20% 和 60% 的蔗糖分離緩沖液（聚胺，水相或己二醇法的緩沖液），然后以線性形式加到一 50 ml 的聚碳酸酯離心管中，用梯度生成器形成沿離心管的密度梯度。
2. 將染色質(zhì)粗品溶液輕輕地加到梯度上，用帶吊桶式轉(zhuǎn)頭的 JS-13 ( Beckman Instruments ) 或 HB-4 ( Sorvall) 離心機(jī)在 2500 g 離心 15 分鐘。
3. 3 ml —份輕輕地從梯度頂部取出樣品，取少量用相差顯微鏡檢查染色質(zhì)的存在情況。
4. 收集含染色體的組分在 3000 g 離心 10 分鐘。
5. 用大約為起始染色體粗品溶液體積 1/30 的分離緩沖液重懸浮染色體，繼續(xù)下一步研究。
 
五、Percoll梯度法
實(shí)驗(yàn)材料：染色質(zhì)
試劑、試劑盒：精胺、精咪、Percoll、溶液
儀器、耗材：聚碳酸酯離心管
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 在體積為 10 ml 分離得到的染色質(zhì)物質(zhì)中加入精胺和精咪至終濃度分別為 0.8 mmol/L 和 2 mmol/L。
2. 加入 10 ml Percoll 溶液，勻漿分離得到的染色質(zhì)。
Percoll 溶液：
89% (v/v) Percoll
5 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
2 mmol/L EDTA
0.8 mmol/L 精胺
2 mmol/L 精咪
0.1 % 毛地黃皂苷
3. 再加 15 ml Percoll 溶液到勻漿中，充分混勻。
4. 將 35 ml 的 Percoll 混合物加入 50 ml 的聚碳酸酯離心管中，用一固定角度轉(zhuǎn)頭（Beckman Instruments) 在 4℃，20000 r/min 離心 30 分鐘。
5. 吸出染色體帶上面的全部物質(zhì)，將梯度中的染色體回收于大約 10 ml 的 Percoll 溶液中。
6. 為了除去 Percoll 顆粒，以 1:2 比例用稀釋緩沖液稀釋染色體，1400 g 離心 45 分鐘進(jìn)行濃縮。
 
六、甘油梯度法
實(shí)驗(yàn)材料：染色質(zhì)
試劑、試劑盒：甘油、染色質(zhì)、分離緩沖液溶液
儀器、耗材：JS-13 轉(zhuǎn)桶式轉(zhuǎn)頭
實(shí)驗(yàn)步驟：
1. 準(zhǔn)備 5 份 6 ml 的 10%、20%、30%、40%、50%（v/v）甘油/染色質(zhì)分離緩沖液溶液。
2. 用 JS-13 轉(zhuǎn)桶式轉(zhuǎn)頭在 4℃，1000 r/min 離心 50 分鐘進(jìn)行染色質(zhì)梯度沉降。
3. 以 3 ml —份收集梯度頂部組分。
4. 每一組分固定少量樣品（10~20 ml）于載玻片上，用相差顯微鏡觀察確定含染色體的組分。
5. 收集含有純化的染色體的樣品。
6. 制備得到的樣品用 JA-20 轉(zhuǎn)頭在 4℃，5000 r/min 離心 15 分鐘以除去其中的甘油，用分離緩沖液重懸浮染色體沉淀。


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