ABI 8200 FMAT的理想替代技術：“混合即讀一步法檢測”模式

ABI 8200 FMAT的理想替代技術：“混合即讀一步法檢測”模式，給您帶來不用于ELISA和流式的抗體篩選新體驗

以抗體技術為基礎的免疫檢測應用和相關的疾病治療領域如癌癥，自身免疫系統(tǒng)疾病等一直推動著抗體篩選的研究。單克隆抗體由特定的細胞系分泌到上清液中，而對上清液中特異性抗體的篩選則成為了藥物初期研發(fā)的核心領域。

均相結合實驗

盡管ELISA和流式細胞儀等傳統(tǒng)手段被廣泛應用，但是這兩種檢測手段都存在各自的局限性，特別是對細胞表面低表達抗原的檢測。同時，這兩種平臺需要很繁瑣的洗板和孵育的步驟而且耗費大量細胞和時間才能獲取數(shù)據(jù)。為了解決這些技術瓶頸，我們開發(fā)了Mirrorball這個高靈敏度檢測平臺和“混合及讀數(shù)之一步法檢測”的實驗方案，這樣就大幅度地提高了抗體篩選的通量并且避免了繁瑣的實驗步驟。您所需要進行的實驗僅僅是將所有的反應物一次性地加入到孔中并孵育一段時間。這里待檢測的可以是結合在微球上的可溶性抗原也可以是細胞表面表達的抗原，一旦反應達到平衡狀態(tài)，那么結合了待測抗體的微珠或細胞可以很快地通過熒光標記的二抗來檢測到。相比于流式和傳統(tǒng)ELISA，Mirrorball通過一種均相免洗的方式，讓您利用最少的試劑耗材、最低的時間、人力成本以及更高的通量和自動化整合來進行抗體藥物的初篩。希望給您帶來最為簡便和高效的抗體藥篩選體驗，別適用于研究昂貴和低豐度的抗原。

均相抗體結合實驗的分析

Mirrorball和另一款類似產(chǎn)品ABI 8200 FMAT 都在設計上融入了很多適用于均相結合實驗的特性。通過使用激光作為激發(fā)光源和光電倍增管作為檢測裝置，這使得它們能夠檢測到低親和力的抗體和低豐度的抗原的結合。兩個系統(tǒng)都在光路設計上最大程度的降低了背景熒光并在掃描讀數(shù)的時候大幅度的提高了信噪比。在這個應用介紹里我們特別的比較了兩個平臺 Mirrorball和ABI 8200 在通過細胞水平實驗進行抗體篩選時的性能優(yōu)異性。通過對比，我們展示了Mirrorball的多重熒光檢測能力，這使多重抗原標記并同時檢測成為了可能。

方法

細胞系和培養(yǎng)方法

在這項研究中，比較了Mirrorball和ABI8200系統(tǒng)在進行A431細胞EGFR抗體結合實驗時的。 A431細胞

在EMEM培養(yǎng)（EBSS）（Sigma公司）含10％胎牛血清，2mM谷氨酰胺（Sigma公司），1X非必需氨基酸（NEAA）（Sigma）和100 U / mL青霉素以及100 U / ml鏈霉素。 A431細胞培養(yǎng)至80％匯合度時用0.25％胰蛋白酶和EDTA收集，洗凈懸浮在培養(yǎng)基中。除非另有說明，培養(yǎng)試劑均購自Life Technology。

抗體和試劑

檢測抗體，鼠抗人表皮生長因子抗體（抗EGFR抗體），購自Merck Chmicals Ltd（＃GR01）。山羊抗鼠IgG，AlexaFluor647 （＃A21235）由Life Technologies公司提供。

CFSE標記

5（6） - 羧基二乙酸N -琥珀酰亞胺酯（CFSE）（Sigma公司）配置為100mM在DMSO溶液里。 CFSE（10nM）被添加到細胞里并在室溫中孵育10分鐘。用4％FBS的PBS（2ml）終止反應。進一步孵化，于37° C下10分鐘后，細胞1000 x g離心5分鐘。

EGFR實驗

抗EGFR抗體在培養(yǎng)基中梯度稀釋，并添加20ul到384孔板中（Costar＃3712）。對于Mirrorball系統(tǒng)，暫停用CFSE標記A431細胞含有1 ×10⁵個細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。對于ABI的8200平臺，準備A431細胞的懸浮液包含4× 10⁵細胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先，加入在各孔中加入20uL混合有熒光二抗的細胞懸液在37℃，孵育2小時。分別在Mirrorball和ABI8200平臺上進行掃描并測定結合有EGFR抗體的細胞數(shù)量。最后，Mirrorball和ABI8200的濃度分別為2000細胞/孔和8000細胞/孔，3 nM抗體結合（圖1）。

圖1. Mirrorball表皮生長因子受體檢測示意圖。ABI 8200的實驗protocol基本一致，除了加入的A431濃度為4 X 10⁵細胞/ ml。

Mirrorball的數(shù)據(jù)掃描和獲取

微孔板進行掃描，使用488和640納米的指定激光器。每孔中的細胞都會 “on”使用TTP LabTech公司

專利的閾值算法和兩種形態(tài)熒光參數(shù)前面所述報告鮑文和衛(wèi)理（1）。全井掃描和數(shù)據(jù)可視化中的各種方式，包括直方圖或散點圖，3D熒光強度分布，或整個以及使用Mirrorball的圖像Cellista™軟件。

ABI 8200的數(shù)據(jù)掃描和獲取

使用640 nm激光掃描樣品。進行細胞計數(shù)和熒光總強度導出到Excel文件和處理如 Lee et al（2）。實驗數(shù)據(jù)僅僅收集了孔中心1 mm²的面積大小的區(qū)域。

數(shù)據(jù)結果

為了比較Mirrorball和ABI 8200在EGFR檢測靈敏度方面的差異性，將A431細胞與梯度稀釋的EGFR一抗以及AlexaFluor647標記的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用Mirroball分析時，用CFSE對細胞進行染色，預先定位細胞并進行計數(shù)，細胞量為384孔板每孔2000個。對于ABI的8200， A431細胞量為每孔8000個接種。

圖2表明，Mirroball檢測靈敏度和ABI 8200 一樣，從5 ng /ml抗EGFR抗體濃度開始，熒光隨著濃度升高而逐漸加強。兩種方法在一抗?jié)舛雀哂?00ng/ml的時候，都檢測到了一個較強的熒光減少。這也是報道過的 “鉤狀效應”（2）。在這里，主要是過量的一抗過飽和了，阻止了熒光二抗的結合和最終的實驗讀數(shù)。

圖2 抗EGFT抗體和 A431細胞結合的抗體濃度依賴的熒光強度曲線

Mirrorball的多激光能力提供了一個獨有的優(yōu)越性，對細胞的識別不會受到較低抗體結合的影響。而ABI 8200只配備了單一的640 nm激光，因此也只能檢測高過背景的熒光。然而，在使用Mirrorball 時由于用CFSE（488nm）染料對細胞進行單獨染色，細胞的計數(shù)就不再依賴熒光抗體的結合（圖3）�？煽康募毎�計數(shù)也同時增加了數(shù)據(jù)的穩(wěn)健性。

圖3 Mirrorball允許不依賴熒光抗體的結合量來測量CFSE標記的細胞。而在ABI 8200平臺上，細胞必須有熒光抗體的結合才能被檢測的到

不僅Mirrorball提供了和ABI 8200一樣的高靈敏度，而且與ABI 8200只能掃描1 mm²的區(qū)域相比，它能夠掃描整個孔內(nèi)的細胞并且不受細胞分布的影響（圖4）。由于ABI 8200有限的掃描區(qū)域，往往需要較高的細胞數(shù)目來獲得更具有統(tǒng)計學意義的結果。

圖4 Mirrorball和ABI 8200掃描區(qū)域的對比

使用Mirrorball 可以大幅度的減少每孔中細胞的用量，這對一些生長緩慢比較少量的細胞系特別適用，可以節(jié)省實驗的消耗。

Mirrorball的軟件Cellista能夠像ABI 8200一樣進行數(shù)據(jù)的處理并直接呈現(xiàn)出hit孔的位置，這個功能可以使我們兼容之前ABI 8200上的實驗數(shù)據(jù)。這里EGFR實驗就是個很直接的案例，不需要改變現(xiàn)有的protocol可以直接在Mirrorball上進行實驗。

圖5 使用每個微珠或細胞的平均熒光強度來代表hit

討論

均相反應和“混合即讀數(shù)一步法檢測”模式特別適合生物醫(yī)藥研發(fā)，尤其在高通量抗體藥物篩選階段。因為這種模式能減少洗板和孵育的次數(shù)并增強檢測的靈敏度，對比傳統(tǒng)的ELISA大大縮短了實驗時間，提高了實驗通量。同時也要比流式細胞儀等儀器更有優(yōu)勢，也可以減少細胞和試劑的用量。

這里我們比較了Mirrorball和ABI 8200的檢測靈敏度，實驗結果表明Mirrorball的靈敏度同樣優(yōu)異，可以將原有在ABI 8200上進行的實驗直接轉(zhuǎn)移到Mirrorball上進行。

Mirrorball是第一臺能夠完成多重激光同時掃描的儀器，能夠同時將不同熒光關聯(lián)起來。當使用不同的熒光染料的時候，特別是應用在抗體篩選的實驗時候，這種特性就能提供卓越的多重熒光的檢測能力，

包括同時檢測多種抗原或者同時檢測不同標記的細胞表面抗原的能力（例如，野生型和轉(zhuǎn)基因細胞系）。

總體上，TTP Labtech的Mirrorball 微孔板細胞儀的“混合即讀數(shù)”檢測方法能夠為可溶性抗原或細胞表面抗原的檢測提供最穩(wěn)健的數(shù)據(jù)結果。自動化的抗體篩選技術整合混合即讀數(shù)的實驗方式，將高靈敏度檢測和高內(nèi)涵抗體篩選有機結合起來，可以提高藥物篩選的效率。因此，Mirrorball也是一個非常理想的ABI 8200的替代產(chǎn)品，將成為下一代的抗體篩選平臺。