Nature Methods：單細(xì)胞TCR研究新進(jìn)展

今年三月份，來自英國的科學(xué)家Michael Stubbington博士和TapioLönnberg博士一起，基于Fluidigm公司C1 mRNA測序樣本及相應(yīng)數(shù)據(jù)，開發(fā)出一套用于研究T細(xì)胞基因序列信息的開放型分析工具---TraCeR，同時結(jié)合T細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，從而進(jìn)一步揭示在不同免疫反應(yīng)中蘊(yùn)含的更深層次的T細(xì)胞功能特異性。該研究成果發(fā)表在著名的《nature methods》雜志上。

原文鏈接：http://www.nature.com/nmeth/journal/v13/n4/full/nmeth.3800.html

 

 

當(dāng)機(jī)體受到外源性入侵時，免疫系統(tǒng)會召集所有免疫細(xì)胞亞群通過產(chǎn)生免疫反應(yīng)與病原體進(jìn)行對抗。由于病原體存在著多種多樣的差異，因而相應(yīng)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)和和每個階段內(nèi)涉及的細(xì)胞類型也有所不同。T細(xì)胞受體中V(D)J基因區(qū)域的隨機(jī)重排，導(dǎo)致了T細(xì)胞種類的復(fù)雜多樣化；這種多樣化使T細(xì)胞在識別和殺傷特異外源性抗原時則更為快速、準(zhǔn)確和有效。

 

目前對T細(xì)胞受體（TCR）的主要鑒別方法之一是對其α和β鏈進(jìn)行測序。但是，若要進(jìn)一步全面理解T細(xì)胞反應(yīng)機(jī)理，還需對不同T細(xì)胞亞群內(nèi)部和相互間的表型差異進(jìn)行更精確的識別。傳統(tǒng)免疫學(xué)研究中基于群體細(xì)胞測序獲得的數(shù)據(jù)很難實現(xiàn)對細(xì)胞異質(zhì)性和不同細(xì)胞亞群的特性分析，因此在單細(xì)胞水平進(jìn)行免疫細(xì)胞表型分析越來越廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)研究中。

 

最近，EMBL-EBI和劍橋大學(xué)Wellcome Trust Sanger Institute的Stubbington博士和Lönnberg博士一起，利用Fluidigm公司C1單細(xì)胞mRNA Seq系統(tǒng)快速高通量制備單細(xì)胞全轉(zhuǎn)錄組序列樣本，通過進(jìn)一步的測序獲取了大量單細(xì)胞TCR序列數(shù)據(jù)，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出了一套用于分析T細(xì)胞基因序列和表型的開放型分析軟件---TraCeR，用于研究不同T細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)錄情況和相互間關(guān)系，從而揭示更深層次的T細(xì)胞功能特異性。

 

TraCeR分析方法不但可以提取每個單細(xì)胞的TCR序列信息，還可以平行分析每個細(xì)胞的基因表達(dá)情況；研究人員對那些與不同免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生有密切關(guān)系的TCR序列進(jìn)行了重組，通過這種方法對其中潛在的分子機(jī)制和細(xì)胞功能進(jìn)行深入研究，發(fā)現(xiàn)TCR序列具備類似于二維碼結(jié)構(gòu)的“溯源”能力，與TCR和細(xì)胞亞群的變異，以及揭示機(jī)體的健康和疾病狀態(tài)有著密切關(guān)系。利用這些信息有可能識別和靶向定位與致病性相關(guān)的T細(xì)胞亞群，為復(fù)合抗體、疫苗研發(fā)，腫瘤免疫治療，以及自身免疫系統(tǒng)疾病等研究提供了大量的有效數(shù)據(jù)信息。

 

 

 

對于每一個生物，TCR序列都存在著廣泛的多樣性。“幾乎每一個細(xì)胞都有一個不同的序列,所以對單個細(xì)胞進(jìn)行分析勢必成為一種強(qiáng)有力的研究方法�！盨tubbingto解釋說，“不同于群體細(xì)胞分析，單細(xì)胞研究改變了我們的思考方式。這在免疫學(xué)研究中是至關(guān)重要的；它可以為我們解決那些未知的、備受關(guān)注的問題提供一種新的、更為有效的手段。”

 

“我相信單細(xì)胞分析的影響將是深遠(yuǎn)的，而我們才僅僅看到一個開端。單細(xì)胞分析深入到每個單細(xì)胞內(nèi)部，讓我可以了解它們的‘想法’和機(jī)理，帶給了我非常大的啟發(fā)�！盩raCeR的研發(fā)者之一，長期從事T細(xì)胞研究的Lönnberg博士說。

 

 

Stubbington博士指出，雖然目前有一些利用單細(xì)胞鑒別TCR的方法已經(jīng)發(fā)表了，但是這一新的檢測分析方法無需針對特定的TCR靶向序列進(jìn)行測序；由于利用Fluidigm的C1平臺可以快速實現(xiàn)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組全長測序樣本的制備，因此后續(xù)的測序結(jié)果都可以通過TraCeR進(jìn)行分析；也就是說，當(dāng)進(jìn)行單個T細(xì)胞測序時，在原有實驗基礎(chǔ)上，可以在另一個維度上獲得額外的scRNASeq數(shù)據(jù)。此外，他補(bǔ)充說：“通過對成千上萬個表達(dá)基因的檢測，還可以使研究人員充分的了解每一個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)�！�

 

這對單細(xì)胞測序方法的推廣和降低實驗成本至關(guān)重要�！袄�用TraCeR方法，甚至可以對之前已經(jīng)獲得的T細(xì)胞測序結(jié)果進(jìn)行TCR數(shù)據(jù)分析�！盠önnberg博士指出。

 

 

TraCeR這一新的方法很有可能改變以往我們對T細(xì)胞基因表達(dá)和相關(guān)免疫反應(yīng)的認(rèn)知。其重要性在于在疾病的發(fā)生和治療過程中，T細(xì)胞作為細(xì)胞間相互作用的核心因素，起著不可替代的作用。

 

Stubbington和Lönnberg博士認(rèn)為在不久的將來，針對不同疾病的患者及其不同狀態(tài)，基于單細(xì)胞檢測的方法將會被廣泛應(yīng)用并將有望指導(dǎo)臨床治療和護(hù)理。例如：

·那些具備特異性抗原的細(xì)胞可以與疫苗發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生相應(yīng)的T細(xì)胞記憶。

·在腫瘤、自身免疫、感染性疾病中有著重要意義：在單細(xì)胞水平深入研究淋巴細(xì)胞的異質(zhì)性可以為人們提供大量未知的信息。

·微量樣本研究：這一方法還能幫助科研人員對臨床樣本中很難獲取的微量或痕量細(xì)胞樣本如：罕見T細(xì)胞亞群，循環(huán)腫瘤細(xì)胞等進(jìn)行研究，從而為不同患者制定更有針對性、更有效的個性化治療方案。

·Lönnberg博士還預(yù)測由衰老引起的T細(xì)胞多樣性的降低將受到更多的關(guān)注。

·目前兩位科學(xué)家已經(jīng)將TraCeR方法應(yīng)用于輔助性T細(xì)胞在感染過程中的分化這一研究項目中。

 

 

現(xiàn)有的TraCeR方法可對人和小鼠的TCR序列信息進(jìn)行快速分析；而他們正在進(jìn)一步開發(fā)適用于其他物種的分析模塊——基于由C1獲得的單細(xì)胞全長轉(zhuǎn)錄組序列樣本的測序結(jié)果，對不同物種已知的TCR中V/J區(qū)域基因序列進(jìn)行重組，構(gòu)建一個人工合成基因組數(shù)據(jù)和分析模塊；同時他們還計劃在不久的將來將該方法拓展至B細(xì)胞的深入研究。

 

這一方法創(chuàng)新性地將Fluidigm C1單細(xì)胞自動制備系統(tǒng)，二代測序及新型測序數(shù)據(jù)分析工具完美的結(jié)合在一起，大大提高了單次實驗有效數(shù)據(jù)的產(chǎn)出率，為科學(xué)家們研究T細(xì)胞，深入揭示不同疾病階段中免疫反應(yīng)的機(jī)制提供了新的思路。

 

為了使用戶能夠更加快速方便的獲取并使用這一新的方法進(jìn)行TCR研究，F(xiàn)luidigm公司最近也進(jìn)一步優(yōu)化了其在C1系統(tǒng)中的應(yīng)用方案。用戶可在Fluidigm公司主頁的Script Hub板塊中下載標(biāo)準(zhǔn)的C1 mRNA seq實驗程序和TraCeR分析軟件，對TCR表型及相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行深入分析。

 

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