miRNA信號通路參與創(chuàng)傷性異位骨化

由于外界創(chuàng)傷引起的異位骨化是一種常見的臨床疾病。研究異位骨化的分子機制和分子標簽有助于異位骨化的早期診斷和臨床治療。來自上海交大附屬第六人民醫(yī)院范存義實驗組的孫仰白博士等人發(fā)表在nature子刊《Scientific reports》上的文獻，向我們闡明了miRNA信號通路在異位骨化中的作用機制。

研究背景

外界創(chuàng)傷，手術(shù)或者疾病會引起軟組織的骨化過程導致異位骨化（Heterptopic ossification HO）。異位骨化可以分為三種不同的類型：進行性肌肉骨化癥（FOP），創(chuàng)傷性骨化癥（traumatic HO）和神經(jīng)性骨化癥（neurogenic HO）。然而，目前還沒有一種有效的手段在早期對異位骨化做出判斷，進而為控制骨化過程采取必要措施。因此，研究并尋找異位骨化過程中特異的分子標簽，探究其的分子作用機制顯得格外重要。本研究從miRNA的角度出發(fā)，研究了創(chuàng)傷性異位骨化過程中miR-630的重要調(diào)控作用。

研究結(jié)果 

1.創(chuàng)傷性異位骨化的細胞來源鑒定
通過免疫組化（IHC）和H&E(hematoxylin-eosin)染色分析創(chuàng)傷后的HO患者骨組織樣本，研究人員對不同時期的異位骨化樣本進行了鑒定。然后，通過對內(nèi)皮細胞makers vWF，E-cadherin和CD31及成骨marker的免疫熒光雙標記，研究人員發(fā)現(xiàn)其在未成熟和成熟的HO細胞中都有表達。因此，內(nèi)皮細胞是異化骨細胞的來源。

2.異位骨化特異性miRNA篩選
為了尋找表皮細胞轉(zhuǎn)化而來的異位骨化過程中可能起調(diào)控作用的miRNA，研究人員對成熟HO階段和非成熟HO階段的病人血清樣本進行了全基因組miRNA（該研究中Agilent Human miRNA microarrays (8*60K), 19.0芯片服務(wù)由伯豪生物提供）篩選，發(fā)現(xiàn)了一些上調(diào)與下調(diào)的miRNA。其中，miR-630已有報道是和EMT轉(zhuǎn)化和軟骨分化相關(guān)。因此，研究人員對miR-630進行了進一步的驗證和分析。結(jié)果顯示，相比于正常人，非成熟HO和成熟HO病人的miR-630分別下降20倍和10倍。所以，miR-630可能是一個潛在的HO早期診斷marker。

3.內(nèi)皮細胞HO過程中miR-630的作用
BMP4和TGF-β2是已知的誘導內(nèi)皮細胞-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（EndMT）誘導因子。因此，研人員用這兩個誘導劑處理，誘導HD-MVECs的EndMT。結(jié)果顯示，誘導2個weeks后，miR-630表達顯著下調(diào)。同時內(nèi)皮細胞marker VE-cadherin，occludin下調(diào)，間質(zhì)細胞marker N-cadherin和vimentin表達增加。FCM分析也顯示，MSC-like marker CD90和CD44及CD34和CD45表達也發(fā)生改變。但是，當轉(zhuǎn)入miR-630 mimics時，CD90和CD44又能恢復。因此，miR-630抑制EndMT過程。Western blot實驗也驗證miR-630過表達時，VE-cadherin，occludin上調(diào)，N-cadherin和vimentin表達下調(diào)。

此外，通過對BMP4和TGF-β2誘導的人HD-MVECs進行ALP和alizarin red S染色，研究人員進行了成骨細胞分化檢測。結(jié)果顯示，miR-630 KD可以顯著增加成骨細胞分化，上調(diào)成骨相關(guān)基因表達，而miR-630過表達有相反表現(xiàn)。因此，miR-630抑制HO過程中的骨生成。通過對誘導HO過程中的小鼠X-ray檢測也得到了同樣的結(jié)果。射線密度和骨體積分析顯示，過表達或者KD miR-630可以抑制和促進骨密度和體積。因此，該結(jié)果表明，miR-630下調(diào)對HO相關(guān)的EndMT過程，及MSC-like表型的出現(xiàn)都密切相關(guān)。

4.miR-630作用靶基因鑒定
    既然miR-630調(diào)控HO過程，那么，它的作用靶基因是哪個呢？通過PicTar和TargetScan預測，發(fā)現(xiàn)Slug可能是其靶基因。對Slug的3’UTR區(qū)進行突變，處理miR-630 mimics，報告激團檢測發(fā)現(xiàn)miR-630可以顯著降低對照Slug的表達。同時，異位表達miR-630可以顯著下調(diào)Slug的mRNA和蛋白表達水平，抑制BMP4和TGF-β2引起的Slug上調(diào)。因此，Slug是miR-630的直接調(diào)控靶基因。

為了進一步驗證上述調(diào)控過程，研究人員進行了補救實驗。過表達Slug可以顛倒miR-630誘導的內(nèi)皮markers上調(diào)和間葉細胞marker下調(diào)，補救由于miR-630抑制HO過程中小鼠的后肢礦物沉積。骨密度和體積檢測也顯示，Slug可以補救miR630的抑制作用，修復Osteocalcin，osteopontin和Runx2表達下調(diào)。因此，miR-630對EndMT的抑制和骨生成抑制是通過直接調(diào)控Slug實現(xiàn)的。

5.血清中miR-630的表達是HO診斷的標簽
為了探究miR-630的臨床診斷價值，研究人員對創(chuàng)傷引起的HO患者和無HO的對照Ctrl1及骨折愈后患者Ctrl2進行血清中miR-630檢測。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷8個小時后，miR-630的表達顯著低于Ctrl1和Ctrl2。出現(xiàn)骨異位，手術(shù)3個月后，miR-630在HO中顯著減少，術(shù)后1年，在三組病人中已沒有明顯差別。ROC曲線分析顯示，HO病人的AUC相比非HO病人分別為0.892和0.912。分別以1.25作為分界點，HO相對Ctrl1和Ctrl2的特異性和敏感性都在80%以上，預測能力能達到70%左右。因此，血清中的miR-630表達可以作為HO的診斷標簽。

研究結(jié)果

本研究通過對HO病人血清miRNA檢測，找到了HO相關(guān)的特異性miR-630，后期運用小鼠模型檢測驗證了其生物學功能和下調(diào)靶基因Slug。最后，通過對病人血清的miR-630表達檢測和分析，提出來miR-630作為臨床早期診斷的可能性。該研究是一篇集合基礎(chǔ)和臨床運用的研究，值得我們廣大科研工作者參考。

原文出處: Sun Y, Cai J, Yu S, Chen S, Li F, Fan C. MiR-630 Inhibits Endothelial-Mesenchymal Transition by Targeting Slug in Traumatic Heterotopic Ossification. Sci Rep.2016,6:22729.