運用ACQUITY Arc可靠地對肽圖分析方法進行轉(zhuǎn)換

法參數(shù)的前提下成功地將HPLC方法轉(zhuǎn)換到了現(xiàn)代LC平臺上。

 

表1. 比較圖1中Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和ACQUITY Arc系統(tǒng)鑒定出的52個色譜峰的保留時間。采用Gradient SmartStart技術(shù)補償兩個系統(tǒng)之間的延遲體積差異。通過計算所得的

 

 

在整個實驗室或其它分析場所中部署新的儀器平臺時，確保分析結(jié)果的一致性是非常重要的。

為了比較不同ACQUITY Arc系統(tǒng)的分析結(jié)果，我們采用具有相同核心配置的兩套不同的ACQUITY Arc系統(tǒng)，在如上所述的方法條件下執(zhí)行分析并采集了數(shù)據(jù)。這兩套系統(tǒng)都配置了30 cm CH被動預(yù)加熱器。每套系統(tǒng)分析時所采用的流動相和樣品都是單獨制備的，以模仿實際工業(yè)環(huán)境中不同分析人員在不同實驗室內(nèi)執(zhí)行樣品分析的情形。如圖2所示，兩個系統(tǒng)所得的英夫利昔單抗肽圖具有良好的一致性。評估兩個系統(tǒng)的相對保留時間差異之后可知，相對保留時間的差異不超過0.006(如表2所示)。采用同一平臺的兩臺不同儀器獲得了幾乎相同的結(jié)果，表明了分析結(jié)果的可靠性。

 

圖2. 比較兩套不同的ACQUITY Arc系統(tǒng)獲得的英夫利昔單抗肽圖：A) ACQUITY Arc系統(tǒng)1和B) ACQUITY Arc系統(tǒng)2。實驗計算了所有標記峰的相對保留時間。色譜峰的選擇由洗脫位置和強度決定。相對保留時間依據(jù)峰1計算。

 

在常規(guī)的肽監(jiān)測分析中，我們通常僅使用光學(xué)檢測技術(shù)測定樣品的相對保留時間和峰面積，然后將這些數(shù)據(jù)與參比標準品的數(shù)據(jù)進行對比，用以確定分析結(jié)果是否符合適應(yīng)性標準。通過引入ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器作為正交檢測方法，我們可借助它提供的質(zhì)量數(shù)信息獲得更加可靠的產(chǎn)品一致性分析結(jié)果。為了獲得上述肽圖方法的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，我們在光學(xué)檢測器之后串聯(lián)了ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器。本實驗采用了填充小粒徑顆粒的色譜柱，目的是充分利用ACQUITY Arc系統(tǒng)能夠同時運行HPLC和UHPLC分離的優(yōu)勢。本示例用2.5 μm色譜柱替代了3.5 μm色譜柱。我們并未因色譜柱粒度改變而對方法進行縮放，而是沿用了之前的60分鐘分析方法，這樣可以充分利用小粒徑色譜柱帶來的分離度和峰容量優(yōu)勢。

 

表2. 比較圖2中兩套不同ACQUITY Arc系統(tǒng)鑒定出的52個峰的保留時間。系統(tǒng)之間的保留時間差異極小。由計算的_值可知，相對保留時間幾乎一樣。

 

圖3A展示了使用3.5 μm色譜柱在Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)上獲得的色譜圖，以便進行比較(另見：圖1A)。圖3B展示了使用2.5 μm色譜柱在ACQUITY Arc系統(tǒng)上獲得的結(jié)果，圖3C展示了相應(yīng)的質(zhì)譜響應(yīng)。將色譜柱粒徑由3.5 μm降至2.5 μm，可以觀察到微小的分離度差異。UV/Vis數(shù)據(jù)與相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)高度相關(guān)，表明ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器可應(yīng)用于常規(guī)分析。

 

ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器的引入，能夠在完成色譜峰表征之后為分析人員提供確證鑒定結(jié)果所需的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，幫助他們進行批釋放測試和產(chǎn)品批次間的比較分析。以肽序列ASQFVGSSIHWYQQR為例，粗體部分表示互補決定區(qū)(CDR)序列。根據(jù)肽的平均質(zhì)量1794.0 Da，我們可計算出相應(yīng)電荷態(tài)離子[M+1H]+1、[M+2H]+2和[M+3H]+3的質(zhì)量分別為1795.0 Da、898.0Da和599.0 Da。圖4A中光學(xué)積分峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與圖4B中峰頂點的質(zhì)譜數(shù)據(jù)相當(dāng)。我們?yōu)锳CQUITY QDa質(zhì)譜檢測器設(shè)定的掃描范圍為350 m/z到最大值1250 m/z。從圖4B的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中我們可以觀察到不同電荷態(tài)都可以落在該掃描范圍內(nèi)。在實驗室環(huán)境中完成表征之后，進一步獲取質(zhì)譜數(shù)據(jù)有助于分析人員對產(chǎn)品進行確認。

 

圖3. 英夫利昔單抗的肽圖對比，分別采用A) Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)和B) ACQUITY Arc系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，圖C)則為通過ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器獲得的相應(yīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)時使用的是填充3.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱，而ACQUITY Arc 系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)時使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18 130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。相應(yīng)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與光學(xué)數(shù)據(jù)高度相關(guān)。

 

圖4. 來自ACQUITY Arc系統(tǒng)的英夫利昔單抗肽圖的放大圖，分別展示了A)光學(xué)數(shù)據(jù)以及B)光譜積分峰的相應(yīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。采集數(shù)據(jù)時使用的是填充2.5 μm顆粒的XBridge BEH C18130 Å, 4.6 mm x 100 mm色譜柱。圖B)中所示的電荷態(tài)分別對應(yīng)為肽序列ASQFVGSSIHWYQQR(粗體部分代表CDR序列)的[M+1H]+1和[M+2H]+2計算所得的值。

 

生物制藥行業(yè)已經(jīng)認識到了應(yīng)用新技術(shù)和新方法的重要性，紛紛向?qū)嶒炇抑幸�入ACQUITY Arc系統(tǒng)等現(xiàn)代化的LC平臺。隨著分析方法越來越頻繁地在整個機構(gòu)中進行轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)換到合同研究機構(gòu)中，我們需要證明分析方法在相同及不同的類似儀器平臺上能夠獲得一致的結(jié)果。ACQUITY Arc系統(tǒng)不僅可以模擬傳統(tǒng)的HPLC方法，還能應(yīng)用Arc Multi-flow path技術(shù)將HPLC方法升級為UHPLC方法。通過將HPLC方法升級為UHPLC方法并結(jié)合ACQUITY QDa質(zhì)譜檢測器，我們可以將常規(guī)的質(zhì)譜檢測結(jié)合到分析中，以利于結(jié)果的確認。

 

參考文獻

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