宮內(nèi)干細(xì)胞移植的新方法（先天性脊椎裂胎鼠）

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雌性Wistar大鼠86只（由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)室提供，合格證號：SCXK京2009-0004），在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，合籠并陰道涂片確認(rèn)孕0天，于孕10天維甲酸口服給藥制備胚胎脊柱裂模型[2]。

1.2 材料和設(shè)備

維甲酸；顯微鑷子、顯微剪刀、顯微針持、6-0顯微縫合線；顯微注射針[1]；手術(shù)顯微鏡；手術(shù)加熱墊；

1.3 手術(shù)方法

1.3.1 顯微外科及胎仔外科

孕16天、17天、18天孕鼠，10%水合氯醛按0.32ml/100g體重腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)加熱墊上（預(yù)設(shè)38℃），肛門直腸內(nèi)測溫。調(diào)整手術(shù)顯微鏡，座椅。常規(guī)腹部消毒，腹部正中開腹，暴露雙側(cè)子宮角，術(shù)野外圍鋪溫鹽水紗布。將一側(cè)子宮角輕輕拉出放置在紗布上，清點(diǎn)胚胎數(shù)量，確認(rèn)胚胎頭尾位置，調(diào)整胚胎子宮部位至手術(shù)顯微鏡視野內(nèi)。

鏡下確認(rèn)胚胎脊柱裂部位，在對應(yīng)子宮壁部位做一預(yù)置縫線荷包，逐層剪開子宮壁長約2mm，暴露羊膜，輕輕推壓子宮壁，調(diào)整脊柱裂位置至清晰暴露于鏡下術(shù)野，此時(shí)手術(shù)顯微鏡放大倍數(shù)為20倍，可以清晰見到胚胎的脊髓，滴加37℃預(yù)熱溫生理鹽水保溫保濕（圖1）。

1.3.2 顯微注射技術(shù)

本實(shí)驗(yàn)中作者使用獨(dú)立吹吸顯微注射法進(jìn)行操作，暴露羊膜后，抽吸約2ul轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，將顯微注射針移至鏡下術(shù)野，迅速刺入羊膜后，輕劃羊膜，使羊水外流，對準(zhǔn)脊髓進(jìn)針約2mm深。針頭保持2s，緩慢后退針頭并吹出干細(xì)胞，干細(xì)胞完全注入后，針頭保持在組織內(nèi)不動，保持注射針內(nèi)壓力，停止2s，減少因組織壓力導(dǎo)致移植的干細(xì)胞外溢，之后迅速退出針頭，顯微注射完畢（圖2）。

輕拉預(yù)先縫合在子宮壁的荷包縫線，打結(jié)縫合，檢查子宮壁修復(fù)情況，必要時(shí)可以加針縫合加固(圖3）。將子宮輕輕推回腹腔，并輕輕擠壓腹壁，使其歸位避免腸梗阻。其它胚胎相間隔做同樣操作。                

圖1 預(yù)置縫線荷包

                       Fig.1 Preset Suture Pouch                

圖2 干細(xì)胞顯微注射

                      Fig.2 Stem Cell Microinjection               

圖3預(yù)置荷包打結(jié)

Fig.3 Preset pouch knot  

2結(jié)果

孕20天胚胎切片熒光顯微鏡下觀察脊髓內(nèi)可見間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光成活胚胎數(shù)195例，干細(xì)胞成活率98.5%，（圖4，圖5為圖4局部放大圖），證明干細(xì)胞移植成活，成功。

   圖4 脊髓內(nèi)間充質(zhì)干細(xì)胞（→） ×100 

          Fig.4  MSCs in Spinal ×100