條件恐懼實驗對于小鼠認(rèn)知功能和線粒體功能的影響

【摘要】 目的觀察條件恐懼實驗對于小鼠認(rèn)知功能和線粒體功能的影響。方法成年雄性C57BL／6小鼠60只隨機分為四組：假手術(shù)+生理鹽水組(SN組，”一10)、假手術(shù)+SS 31組(ss組，n—lo)、盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)+生理鹽水組(CN組，”一20)和CLP+SS31組(cs組，”一20)。術(shù)畢每天腹腔注射5 rag／kg SS 31(ss、CS組)或等容生理鹽水(SN、CN組)，連續(xù)6 d。術(shù)后第7、8天，行條件恐懼實驗；行為學(xué)測試后處死小鼠，取海馬組織檢測活性氧自由基(ROS)及三磷酸腺苷(ATP)水平，提取線粒體檢測線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物工、T『、『『『、Ⅳ酶活性及線粒體膜電位(MMP)水平。結(jié)果與CN組比較，SN、SS和CS組24 h場景實驗僵直時間明顯增加(P<0．05)，ROS水平明顯降低，ATP、MMP及復(fù)合物工和仃『酶活性明顯升高(Pd0．05)。與CS組比較，SN和SS組ROS水平明顯降低，人TP、MMP及復(fù)合物I和m酶活性明顯升高(P<0．05)。結(jié)論線粒體抗氧化肽$531可改善膿毒性腦病小鼠認(rèn)知功能，其機制可能與減輕線粒體損傷有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】 膿毒癥；認(rèn)知；線粒體；抗氧化劑；小鼠

膿毒性腦病(sepsis associated encephalopathy，SAE)表現(xiàn)為長期的自主神經(jīng)功能紊亂、譫妄和認(rèn)知功能障礙，其確切機制尚不清楚，且缺少有效治療措施。研究表明線粒體功能紊亂在膿毒癥多器官功能障礙發(fā)生發(fā)展中起重要作用，推測線粒體功能紊亂可能是SAE病理生理學(xué)機制之一。線粒體抗氧化肽SS 31可清除線粒體內(nèi)活性氧自由基(reactiveoxygen species，ROS)及增加三磷酸腺苷(adenosine 5’triphosphate，ATP)水平，具有明顯的線粒體保護(hù)作用。本研究觀察SS 31對SAE小鼠認(rèn)知功能及線粒體功能的影響，為SAE的防治提供參考。

材料與方法

動物選擇與分組成年雄性C57BL／6小鼠60只，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供，體重20～28 g。隨機分為四組：假手術(shù)+生理鹽水組(SN組，n 10)、假手術(shù)+SS-31組(ss組，咒一lo)、CLP+生理鹽水組(CN組，n 20)和CLP+SS31組(cs組，n 20)。CN組和CS組采用盲腸結(jié)扎穿孔法(CLP)建立SAE模型，SN組和SS組僅做剖腹、分離盲腸遠(yuǎn)端、關(guān)腹手術(shù)。術(shù)畢連續(xù)6 d，每天分別腹腔注射5mg／kg SS-÷31(SS和CS組，上海強耀生物科技有限公司)和等容生理鹽水(SN和CN組)。CLP模型建立術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉(40mg／kg，Sigma公司)腹腔注射麻醉，腹正中線做1 cm長的切口，游離腸系膜和盲腸，近盲腸根部1．2 CIll處以4-0絲線環(huán)形結(jié)扎，22號針頭于結(jié)扎端貫通穿刺兩次，擠出糞便少許，還納腸段，依次縫合腹膜和皮膚，所有操作均于8 min內(nèi)完成。

行為學(xué)測試

術(shù)后第7天存活小鼠參照文獻(xiàn)進(jìn)行條件性恐懼實驗。將小鼠置于75％酒精擦拭的實驗盒中探索180 S，隨后給予聲音刺激(80dB，3600 Hz)60 S，緊接著給予足部電刺激(0．75mA，1 s)，小鼠繼續(xù)適應(yīng)180 S后取回。分別于訓(xùn)練后2 h及24 h進(jìn)行場景和聲音實驗，其中場景實驗主要反映海馬依賴性記憶，聲音實驗主要反映非海馬依賴性記。V,E8I。場景實驗將小鼠放入相同的環(huán)中390 S，記錄第2個180 S內(nèi)僵直時間。聲音實驗將小鼠放不同的環(huán)境中390 S，第2個180 S時給予相同聲音刺激而無電擊，記錄僵直時問。實驗時采用條件恐懼實驗系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng))自動記錄小鼠在電擊箱內(nèi)的活動狀態(tài)。每次實驗結(jié)束后，用75％的酒精擦洗底座，避免氣味對實驗的干擾。ROS和ATP水平檢測 行為學(xué)測試后各組取5只小鼠處死，取新鮮海馬組織勻漿，參照ROS試劑盒(fin海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)和ATP試劑盒(fin海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書步驟檢測ROS和ATP水平。復(fù)合物I、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)檢測行為學(xué)測試后各組取5只小鼠處死取新鮮海馬組織，參照線粒體提取試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書步驟提取并純化線粒體。復(fù)合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性和MMP水平參照線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性檢測試劑盒和純化線粒體膜電位熒光測定試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)說明書步驟進(jìn)行操作。

統(tǒng)計分析

采用SPSS 17．o軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(i±s)表示，組問比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。

結(jié) 果
條件性恐懼實驗本研究中，CN組與CS組小鼠死亡數(shù)分別為9只和6只，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，SN組與SS組小鼠未見死亡，存活小鼠完成條件性恐懼實驗。與CN組比較，SN、SS和CS組24 h場景實驗僵直時間明顯增加(P

ROS、ATP和MMP水平變化 與CN組比較，SN、SS和CS組ROS水平明顯降低(P復(fù)合物工、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性 與CN組比較，SN、SS和CS組復(fù)合物工和Ⅲ活性明顯升高(P<0．05)；與CS組比較，SN和SS組復(fù)合物I和Ⅲ活性明顯升高(P<0．05)。

討 論

本研究觀察到CLP小鼠術(shù)后8 d時24 h場景實驗僵直時問明顯減少，表現(xiàn)為海馬依賴性的認(rèn)知功能損傷，并伴隨海馬組織中ROS水平升高，ATP水平降低，以及線粒體中復(fù)合物工、Ⅲ酶活性和MMP水平的降低，我們推測線粒體電子傳遞鏈功能損傷引起ROS水平增加和ATP水平降低是膿毒癥線粒體功能紊亂及SAE認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機制之一。

膿毒癥時，不同組織線粒體電子傳遞鏈損傷不盡相同。Comim等觀察到CLP大鼠24、48和96h時小腦、海馬、紋狀體和腦皮質(zhì)線粒體復(fù)合物工酶活性明顯降低，復(fù)合物Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶活性未見明顯改變，而d’Avila等觀察到CLP大鼠24 h時腦組織復(fù)合物Ⅳ活性明顯降低。此外，Peruchi等E113觀察到CLP大鼠骨骼肌組織中復(fù)合物Ⅱ、Ⅲ酶活性12 h時降低，48 h時所有復(fù)合物活性均降低。Zapelini等則觀察到肝組織中復(fù)合物Ⅳ活性3～48 h時降低。而在本研究中，我們觀察到CLP小鼠8 d時，大腦海馬組織中復(fù)合物工和Ⅲ酶活性明顯降低，復(fù)合物Ⅱ和Ⅳ酶活性無明顯改變，這一變化可能與CLP的時問及組織不同有關(guān)。線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物酶活性及MMP是線粒體功能的重要參數(shù)，其中復(fù)合物工和Ⅲ是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的主要部位，其活性降低可引起ROS明顯增加。而MMP是ATP形成的先決條件，在電子傳遞的過程中，質(zhì)子可通過復(fù)合物工和Ⅲ逆濃度梯度進(jìn)入線粒體膜外形成線MMP，并經(jīng)過ATP合酶順濃度梯度進(jìn)入線粒體產(chǎn)生ATP，所以復(fù)合物工和Ⅲ酶活性降低可引起MMP降低，進(jìn)而引起ATP產(chǎn)生的減少。故本研究中CLP引起小鼠海馬線粒體功能紊亂，主要表現(xiàn)為線粒體復(fù)合物工和Ⅲ酶活性和MMP水平降低且伴隨ROS水平增加以及ATP水平的降低。

線粒體抗氧化肽SS-31可自由通過血腦屏障和細(xì)胞膜，在線粒體內(nèi)膜濃度為線粒體外濃度1 000倍以上，且不依賴于線粒體膜電位。SS 31可清除細(xì)胞內(nèi)各種ROS如過氧化氫(H。O。)、超氧陰離子(OF)及羥自由基(·OH)等，具有增加ATP的產(chǎn)生及穩(wěn)定線粒體膜電位等作用，在神經(jīng)退行陛疾病、代謝性疾病以及缺血一再灌注損傷等疾病中發(fā)揮重要保護(hù)作用。本研究我們觀察到SAE小鼠模型中連續(xù)給予SS-31可使24 h場景實驗僵直時間增加，改善小鼠認(rèn)知功能，并減少海馬組織中ROS水平，增加ATP和MMP水平，以及抑制復(fù)合物工和Ⅲ酶活性的降低，具有明顯的線粒體保護(hù)作用。

綜上所述，線粒體功能紊亂可能是SAE認(rèn)知功能障礙的病理生理學(xué)機制之一，連續(xù)給予線粒體抗氧化肽SS 31可改善膿毒性腦病小鼠的認(rèn)知功能，其作用可能與保護(hù)線粒體功能有關(guān)。