生物標志物（Biomarker）的篩選與驗證方案

臨床樣本都是寶，別讓它們睡到死�。�！

在與很多醫(yī)生和老師的交流過程中，經(jīng)常會收到這樣的反饋：手上收集了很多臨床樣本，但是沒有具體方案，不知道怎么利用，樣本越收越多，冰箱越裝越滿，但最終這些樣本一直是在睡大覺，睡到死！針對于此，本期向大家推薦吉凱完整的Biomarker篩選方案。進一步可開發(fā)試劑盒，完成臨床轉(zhuǎn)化，造福于民；退一步可發(fā)表高分文章。

今年7月，國家科技部發(fā)布了《“精準醫(yī)學研究”重點專項2017年度項目申報指南建議》，建議指出“……建立多層次精準醫(yī)學知識庫體系和生物醫(yī)學大數(shù)據(jù)共享平臺，突破新一代生命組學大數(shù)據(jù)分析和臨床應(yīng)用技術(shù)，建立大規(guī)模疾病預(yù)警、診斷、治療與療效評價的生物標志物、靶標、制劑的實驗和分析技術(shù)體系，形成重大疾病的精準防診治方案和臨床決策系統(tǒng)，建設(shè)中國人群典型疾病精準醫(yī)療臨床方案的示范、應(yīng)用和推廣體系……”。

精準醫(yī)療的本質(zhì)是通過基因組、蛋白質(zhì)組等組學技術(shù)和醫(yī)學前沿技術(shù)，對于大樣本人群與特定疾病類型進行生物標記物的分析與鑒定、驗證與應(yīng)用，從而精確尋找到疾病的原因和治療的靶點，并對一種疾病不同狀態(tài)和過程進行精確分類，最終實現(xiàn)對于疾病和特定患者進行個性化精準治療的目的，提高疾病診治與預(yù)防的效益。

生物標志物（Biomarker）是指可以標記系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標，具有非常廣泛的用途。不僅可從分子水平探討發(fā)病機制，而且在準確、敏感地評價早期、低水平的損害方面有著獨特的優(yōu)勢，可提供早期預(yù)警、預(yù)后療效分析、疾病精準的分期分型依據(jù)等，在很大程度上為臨床醫(yī)生提供了輔助診斷的依據(jù)。由此不難看出，Biomarker與精準醫(yī)療的理念不謀而合，在疾病的準確診斷上有著高度統(tǒng)一。

利用不同組學技術(shù)通過高通量篩選尋找不同疾病發(fā)生原因、早診、預(yù)后、分型等不同層面的Biomarker，對同一種疾病的不同狀態(tài)和過程進行精確分類，從而在此基礎(chǔ)上對于疾病和特定患者設(shè)計個性化精準治療方案。在這一層面看來，Biomarker是精準醫(yī)療的前提，精確的Biomarker對于后續(xù)針對不同疾病實施精準醫(yī)療有著非常重大的意義，因此，Biomarker早期篩選和后期Panel的建立與驗證就顯得尤為重要。

針對于Biomarker的篩選與驗證，吉凱整合多個平臺，開發(fā)了整體一站式服務(wù)，在提出臨床問題的基礎(chǔ)上，提供樣本與臨床資料，即可完成從篩選到驗證到試劑盒開發(fā)的整套流程。

臨床問題提出：臨床問題是Biomarker篩選的核心創(chuàng)新點，它可以是疾病的早診預(yù)判、藥物用藥后的療效分析，也可以是疾病分級判斷或是預(yù)后療效分析等等。但凡是在臨床上可以提出的問題，并且可以收取相應(yīng)樣本，都可以作為Biomarker篩選的立足點。

臨床樣本分組積累與臨床數(shù)據(jù)積累：臨床樣本是Biomarker篩選的基礎(chǔ)，因此在提出臨床問題的同時，需要考慮可以收取的樣本量，從前期的篩選到后期的驗證都是需要足夠的樣本支持，一般來說年收樣本量最好在百例以上，樣本來源多種多樣，基本原則是無創(chuàng)或是微創(chuàng)的樣本優(yōu)先考慮，全血、血清、血漿、尿液、唾液、組織、腦脊液甚至FFPE都作為篩選樣本。對于分組來說，至少有對照組與實驗組，比較嚴謹?shù)姆桨竿�往還會將實驗組進行細分以及加入輔助分組。此外臨床信息也十分重要，患者的臨床資料、病理診斷結(jié)果、隨訪記錄……這些臨床信息是后期建立診斷Panel的基礎(chǔ)，可以大大提高Biomarker的可靠性。

高通量篩選和數(shù)據(jù)分析：依據(jù)樣本條件及個人興趣選取相應(yīng)的高通量篩選方法，從組學層面考慮，可以是基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，從篩選方法考慮，可以是測序、芯片、質(zhì)譜等等。通過高通量手段獲得的數(shù)據(jù)是非常龐大的，這時就需要擁有強大的生物信息學團隊對原始數(shù)據(jù)進行分析，從中挖掘出有價值的東西（候選Biomarker）。

中低通量技術(shù)擴大樣本驗證：經(jīng)過高通量篩選與生信分析，將挖掘出來的候選Biomarker再回歸臨床進行中低通量的擴大樣本驗證。不同層面的Biomarker可選取不同的方法，SNP/SNV用Sequenom，表達量、表觀marker、CNV用qPCR，蛋白類可以用ELISA、western及IHC等方法。理論上講驗證樣本數(shù)量越多越好，一般至少在百例左右。

新檢測試劑盒開發(fā)： 獲得Biomarker之后結(jié)合生物信息學分析建立診斷Panel，開發(fā)臨床檢測試劑盒，并進行臨床檢測，驗證Panel的有效性。

篇幅受限，下面列舉一個Biomarker篩選的經(jīng)典案例：Plasma microRNA panel to diagnose hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma。這篇文獻是由復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院肝癌研究所樊嘉教授領(lǐng)銜課題組在2011年發(fā)表于Journal of Clinical Oncology。文中利用Agilent microRNA芯片篩選、RT-PCR驗證等方法在HBV相關(guān)肝癌患者血漿中篩選到了由7個microRNA組成的早期肝癌診斷分子標記物，該檢測方法對小于2cm的HBV相關(guān)肝癌診斷準確率接近90%，效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。

按照Biomarker篩選整體方案解析一下這篇文獻。第一，提出的臨床問題為HBV相關(guān)的肝癌早診，目標明確；第二，臨床樣本為微創(chuàng)收集的血漿，良好的Biomarker來源，且有詳細的臨床信息，對于分組來說除了對照組（正常人）和實驗組（HBV相關(guān)肝癌患者）之外，還加入了輔助分組慢性乙型肝炎和肝硬化，設(shè)計嚴謹，有效排除可能存在的干擾；第三，利用miRNA芯片篩選到15個差異miRNA；第四，利用qPCR在407例樣本中進行中低通量驗證15個差異miRNA，縮小靶標miRNA范圍至7個；第五，結(jié)合臨床數(shù)據(jù)，重新進行生物信息學分析，建立Panel，再于390例樣本中驗證Panel的有效性，發(fā)現(xiàn)使用該panel對HBV相關(guān)肝癌早診有效率高達94.1%，此外，區(qū)分區(qū)分肝癌與慢性乙型肝炎的準確率達84.2%，區(qū)分肝癌與肝硬化的準確率達88.4%。

Biomarker作為最直接快速有效的診斷手段，其篩選與獲得可在疾病診斷、發(fā)展、治療、以及療效監(jiān)測等多個方面發(fā)揮重要的作用。近年來尋找和發(fā)現(xiàn)有價值的Biomarker已經(jīng)成為目前研究的一個重要熱點。精準醫(yī)療是醫(yī)學的未來發(fā)展方向，包括精準預(yù)防，診斷，治療和預(yù)后四個層面。精準醫(yī)療發(fā)展關(guān)鍵在于Biomarker的發(fā)現(xiàn)與臨床實踐。

各位手頭有臨床樣本的老師，趕快行動起來，別再讓您的樣本睡大覺。