Molecular Devices使用多能誘導干細胞(iPSC)來源的肝細胞球進行高內(nèi)涵3D毒性分析

• 使用人類多能誘導干細胞來源的肝細胞形成肝細胞球

• 對體外篩選的3D模型進行肝毒性評價

• 3D圖像分析過程中對目標樣品進行識別和分割，以達到最佳分割效果

背景介紹：

在發(fā)育生物學和組織生物學中，3D細胞球建模方式能夠加快轉(zhuǎn)化研究進程，因此越來越受到人們的重視。如何對3D樣本進行更高通量的定量分析成為了熱門研究課題。

在本實例中，MD公司建立并優(yōu)化了一種分析方法，能夠?qū)θ祟惗嗄苷T導干細胞來源的3D肝細胞球進行共聚焦成像和毒性評估（圖1）。

使用免洗染色法進行肝毒性評價：

1. 用肝毒性測試化合物處理細胞球72小時

2. 用溶解于無菌PBS中的三種熒光染料對細胞球進行染色。三種染料的濃度分別為：

• 2 μM calcein AM

• 3 μM EthD-1

• 10μM Hoechst 33342 (Life Technologies)

此外，為了評價化合物對凋亡信號的激活和對線粒體形態(tài)的影響，所用的染料濃度分別為：

• 7.5 μM CellEvent Caspase 3/7

• 200 nM MitoTracker Orange (Life Technologies)

肝細胞球的形成：

本實例使用的細胞為：

• 人類多能誘導干細胞來源的肝細胞 iCell Hepatocytes 2.0 (Cellular Dynamics International)

• HepG2細胞 (ATCC)

操作流程

1. 按照標準操作流程將凍存細胞復蘇；

2. iCell Hepatocytes 2.0 鋪板進行2D培養(yǎng)；

3. 貼壁細胞用Accutase酶消化后與Geltrex 基質(zhì)(ThermoFisher Scientific)混合，細胞混合液以1000 cells/well的密度種植在低吸附成球孔板中(InSphero or Corning)；

4. 將孔板以300 g轉(zhuǎn)速離心2分鐘使細胞沉淀并去掉基質(zhì)中的氣泡，然后將孔板放入細胞培養(yǎng)箱，在37°C, 5% CO2條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)HepG2 細胞無需加入基質(zhì)；

5. 培養(yǎng)24–48小時后細胞球形成。

將染料加入細胞球培養(yǎng)體系中孵育2小時，然后采集圖像。染料無需洗脫，加樣過程小心謹慎，避免損傷細胞球進而造成細胞球解體或偏離原位。典型的細胞球染色結果如圖 2所示。

高通量3D圖像的采集和分析過程：

采用ImageXpress® Micro 共聚焦高內(nèi)涵成像系統(tǒng)(Molecular Devices)采集圖片，具體設置如下：

• 物鏡種類--10倍鏡和20倍鏡

• 層掃間距--5-10μm

• 層掃范圍--100-120μm

• 層掃起始位置--多孔板孔底

所有的結果中都包含有2D maximum投射圖像，分析過程中可以對這些圖像進行保存和調(diào)用。

識別并分析3D樣品

使用MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集分析軟件對3D圖像進行分析。CME用戶模塊編輯器中新增了3D分析模塊(圖3) ，該模塊能夠?qū)?D結構的體積、熒光強度、距離等參數(shù)進行量化并對圖像進行批量分析。其中 “Find Spherical Objects”功能可以對目標結構的形態(tài)學參數(shù)（最小和最大寬度，最小和最大Z軸層數(shù)）和目標結構與背景之間熒光強度的差值進行自定義設置，對不同大小的目標結構（小到細胞器，大到多細胞團）進行定義。比如將形態(tài)參數(shù)設定為：

• 細胞核寬度范圍--5-15 μm

• 細胞核層數(shù)--1-2層

• 細胞核與背景的熒光強度差--200 熒光單位

• 肝細胞球?qū)挾确秶?-100-300 μm

• 肝細胞球?qū)訑?shù)--5-7層

• 肝細胞球與背景的熒光強度差-- 400 熒光單位

分析結果包括每個目標結構的球體體積、直徑（或平均體積、平均直徑），以及特定熒光通道中球體的總熒光強度和平均熒光強度等參數(shù)。

“Find Spherical Objects”功能還可用于識別單個細胞和細胞核或利用適當?shù)奶卣鲗⒉煌�的單細胞區(qū)別開來。此外，3D分析模塊可以按照用戶自定義選項“Connect by BestMatch”, “Connect byTouching”, 和 “Do NotConnect Objects”將不同層面的目標結構連接起來。

首先對Z軸層掃中的每層圖片按照2D圖片進行分割、分析并得到細胞核個數(shù)，細胞死/活和細胞分類等參數(shù)的測量值；其次利用用戶定義的目標結構的最大范圍將其連接起來。如：

• 細胞核最大范圍 3-6 μm

• 細胞質(zhì)最大范圍 20-30 μm

最終，在3D結構中將細胞核或單細胞分割出來。整個過程中目標結構不會丟失也不會被重復計數(shù)。所有的細胞（如：calceinAM 陽性/陰性細胞；Ethidium homodimer陽性/陰性細胞）都會被識別、被計數(shù)。

為了直觀表現(xiàn)目標結構的整體/平均熒光強度、體積、直徑、間距以及目標結構在三維空間中的定位等參數(shù)，可用不同顏色標記單個細胞。利用細胞球標記范圍（ spheroid masking ）對更小的結構進行計數(shù)，這些結構可能在標記范圍（mask）之中或在標記范圍（mask）之外。如：對每孔只含有一個細胞球的樣品進行分析時，利用單細胞標記（ single-cell masking ）可以對所有細胞進行計數(shù)并將位于細胞球中和細胞球外的細胞區(qū)別開來。當細胞球不完整時，這種圖形處理方式就顯得十分重要。對每孔含有多個細胞球的樣品（細胞球與基質(zhì)共培養(yǎng)）進行分析時，這種圖形處理方式可以定義每個細胞球的容量并得出均值。

圖 4A 顯示了不同層面的2D圖像中 calceinAM 陽性細胞的細胞分類結果。利用“Connect by Best Match” 功能可以將細胞在3D空間中連接起來。相同的方法可以分析 ethidium homodimer 陽性/陰性細胞(細胞死/活分析) 也可以分析線粒體、熒光強度、細胞凋亡還可以分析特定染料和標記物。

使用多參數(shù)表型篩選結果進行毒性評價

利用多種肝毒素處理細胞球，觀察細胞球表型和細胞含量的顯著變化。許多細胞球失去了球狀結構，球體發(fā)生崩解，細胞球變得松散、扁平、不規(guī)則。細胞從主體結構中脫離，或出現(xiàn)凝結核，表明細胞已經(jīng)死亡。 當化合物濃度超過一定范圍，細胞表型就會出現(xiàn)上述變化 (圖4B)。 利用圖像量化分析得到的參數(shù)對細胞球的形態(tài)特征、細胞含量和結構復雜程度進行評估。檢測細胞球體積、直徑、熒光強度，同時檢測calcein AM 陽性細胞(活細胞)、EthD-1 陽性細胞（死細胞）個數(shù)。細胞球經(jīng)化合物處理后，細胞總數(shù)沒有變化，死細胞數(shù)量上升，活細胞數(shù)量下降（具有濃度依賴特性）；細胞球和單個細胞（細胞質(zhì)）中calcein AM的平均熒光強度顯著降低。

為進一步研究細胞毒性機制，我們對細胞的凋亡特征和線粒體完整性進行評估。化合物處理細胞球24小時后用caspase 3/7 熒光染料檢測細胞凋亡的活化程度。 caspase 3/7 對細胞球（經(jīng)甲基汞處理的對照組細胞球）的染色結果如圖2B所示。用化合物處理細胞球后會誘導細胞凋亡，導致 caspase 3/7 熒光強度增加，caspase 3/7 陽性細胞（凋亡細胞）的個數(shù)增加。 用MitoTracker Orange 熒光染料染色結果來反映線粒體膜電位的變化情況。用化合物處理細胞球后會破壞線粒體結構的完整，進而導致MitoTracker Orange熒光強度降低（具有濃度依賴特性，圖2C ）

對活細胞個數(shù)、 calcein AM 熒光強度、 calceinAM 陽性細胞含量等參數(shù)進行測量后發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)都完美的符合四參數(shù)劑量反應曲線模型(圖 4B)。IC50 值 (表 2) 由SoftMax® Pro 6 軟件(MolecularDevices)生成。

總結：

在對肝毒性進行評價的過程中，3D肝臟球模型+高內(nèi)涵3D分析模式作為一種反應靈敏、可重復性高的方法，越來越展現(xiàn)出廣闊的應用前景。該方法預測準確率相比于動物實驗和臨床數(shù)據(jù)仍需要繼續(xù)完善。相關模型的進一步發(fā)展，檢測方法的進一步優(yōu)化有利于拓展該方法在體外篩選領域中的應用空間。

參考文獻：

1. Chang, T. T., & Hughes-Fulford, M. (2009).Monolayer and Spheroid Culture of Human Liver Hepatocellular Carcinoma Cell Line Cells Demonstrate Distinct Global Gene Expression Patterns and Functional Phenotypes. Tissue Engineering Part A, 15(3), 559-567.

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3. Kunz-Schughart, L. A. (2004). The Use of 3-D Cultures for High-Throughput Screening:The Multicellular Spheroid Model. Journal of Biomolecular Screening, 9(4), 273-285.

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