徠卡顯微鏡應(yīng)用：種植體周?chē)�炎凈化處理�?duì)牙種植體鈦合金表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)的影響：對(duì)骨整合的影響

http://www.leica-microsystems.com/science-lab/the-effects-of-peri-implantitis-decontamination-treatments-on-the-surface-roughness-and-chemistry-of-a-titanium-alloy-used-for-dental-implants-implications-for-bone-reintegration/

 

種植體周?chē)�炎凈化處理�?duì)牙種植體鈦合金表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)的影響：對(duì)骨整合的影響

 Jordi Diaz-Marcos, PhD ¹  Joan Vilana Balastegui, MSc ¹  Angel F. Espías Gómez, DDS, MS, PhD ² Luis Alberto Sánchez Soler, Dr.  Frédéric Parahy, Dr. ²

 ¹University of Barcelona (UB), 科學(xué)技術(shù)中心 (CCiTUB), 西拔牙巴塞羅那SPM實(shí)驗(yàn)室,

 ²巴塞羅那大學(xué)(UB), Faculty of Dentistry, L'Hospitalet Ll., Spain

2014年2月19日

 

鈦（Ti）合金為生物相容性材料，經(jīng)常用于人體植入物，尤其是在牙科中。本研究對(duì)種植體常用的Ti-6Al-4V（TAV）合金進(jìn)行不同類型的種植體周?chē)�炎（種植體周?chē)�牙齦及牙齒組織感染）牙科處理，以探討合金表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)所受的影響。本研究旨在更好地了解這些常用的牙科處理方法是否有助于提高種植體與骨結(jié)合的能力，即愈合過(guò)程骨再整合到種植體材料中的能力。研究了各種牙科處理方法（比如超聲處理、噴射拋光、激光照明和化學(xué)物質(zhì)處理）對(duì)Ti合金表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)的影響。如果運(yùn)用得當(dāng)，這些牙科方法或可在成功治療種植體周?chē)�炎后提高Ti合金種植體的骨再整合概率。

前言

背景

Ti合金牙種植體長(zhǎng)期的成功應(yīng)用，在很大程度上取決于快速愈合過(guò)程材料與頜骨的安全結(jié)合（骨整合）[1]。Ti合金的表面形貌對(duì)牙種植體的長(zhǎng)期應(yīng)用的成功性至關(guān)重要。過(guò)去十年，為了改進(jìn)骨整合過(guò)程，專家們致力于開(kāi)發(fā)Ti種植體材料的處理方法[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Ti合金種植體的理化改性，導(dǎo)致除骨形成反應(yīng)受到調(diào)節(jié)之外，細(xì)胞募集、黏附、炎癥和骨重建活動(dòng)也受到顯著調(diào)節(jié)[3]。牙種植體應(yīng)用總體上取得了很大成功，大約96%留在患者體內(nèi)10年以上。圖1示出牙種植體（帶基臺(tái)和牙冠）置入口腔頜骨的一般過(guò)程。

近年來(lái)，人們針對(duì)種植體周?chē)�牙質(zhì)組織感染（種植體周?chē)�炎）提出了若干處理策略（機(jī)械、化學(xué)、物理化學(xué)等）[4]。種植體周?chē)�炎是“種植體周?chē)�的發(fā)炎過(guò)程，其特點(diǎn)為軟組織發(fā)炎和支持骨丟失”[5]。如果愈合過(guò)程允許發(fā)生骨整合，將人工基臺(tái)和牙冠安裝到牙種植體上，以取代缺失的牙齒。但如果種植體周?chē)�牙齦和牙質(zhì)組織的炎癥是由細(xì)菌感染引起的，牙種植體將有可能發(fā)生骨丟失并發(fā)癥。有利的牙種植體特性，即氧化鈦有助于細(xì)胞黏附的高度反應(yīng)性，因細(xì)菌存在及其代謝活性殘留而改變。因此，受污染表面相當(dāng)于異物，會(huì)加重種植體周?chē)�軟組織炎癥和骨喪失。種植體周?chē)�炎的處理涉及表面去污和清潔。適當(dāng)使用這些不同的種植體周?chē)�炎處理方法，或許可以使Ti合金表面改性，促進(jìn)宿主對(duì)種植體的反應(yīng)[6]。本報(bào)告討論不同牙科處理方法對(duì)Ti合金種植體材料表面特性的影響，以及種植體周?chē)�炎愈合過(guò)程這些處理方法是否可以加快牙種植體的骨整合。牙種植體骨整合耗時(shí)較長(zhǎng)（3～6月），因此可以加快這種現(xiàn)象的表面改性將縮短愈合時(shí)間，降低失效率，并將患者的不適感降至最低程度[7]。

   

A             B

  

C                                               D

圖1A–D：鈦（Ti）合金牙種植體置入頜骨示意圖：A）置入頜骨的典型Ti種植體；B）與骨結(jié)合的種植體（帶支撐牙冠的固定基臺(tái)；C）和D）種植體示例，帶有基臺(tái)和取替缺失牙齒的粘結(jié)牙橋。

表面粗糙度的影響

改進(jìn)鈦種植體表面形貌，可以增強(qiáng)骨與種植體的接觸以及改進(jìn)界面的力學(xué)性能[8–11]。在缺乏對(duì)照比較臨床試驗(yàn)的情況下，累積的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持使用表面形貌得到改進(jìn)的鈦種植體[12]。

表面粗糙度已被確定為一個(gè)重要的參數(shù)，該參數(shù)與種植體材料錨定到骨組織的能力相關(guān)[13]。增大種植體材料表面粗糙度的方法多種多樣，最常用的是：加工、噴砂、酸蝕、陽(yáng)極氧化、激光改性，或上述技術(shù)的組合。此外，已根據(jù)其表面粗糙度平均值（Sa），即表面的平均峰高和平均谷深，將市售種植體分為四類：光滑（S_a < 0.5μm）、輕微粗糙（0.5μm < S_a < 1.0μm）、中度粗糙（1.0μm < S_a < 2.0μm）和粗糙（S_a > 2.0μm）[14]。另一個(gè)重要的參數(shù)是S_dar，它表示粗糙表面參照完全平坦光滑的表面展開(kāi)后的面積。根據(jù)Teughels等[15]，種植體表面粗糙度及其化學(xué)成分對(duì)菌斑結(jié)構(gòu)數(shù)量和質(zhì)量具有顯著的影響。最后，目前沒(méi)有證據(jù)表明暴露于口腔的種植體表面將形成其成分取決于表面粗糙度的生物膜 [16–17]。種植體形貌如何表示和分類？Wennerberg簡(jiǎn)要回顧了適用于牙種植體的形貌測(cè)量方法。為了解釋平均平面形貌要素的各向同性偏差，必須進(jìn)行三維（3D）測(cè)量[18]。接觸式儀器，比如表面輪廓儀，會(huì)低估表面形貌尺寸。以鈦合金等軟材料制成的螺旋狀種植體，其評(píng)估首選光學(xué)儀器[19]。2D表面測(cè)量和表征的局限性，推動(dòng)了高效實(shí)用的3D表面測(cè)量和表征技術(shù)的開(kāi)發(fā)。借助三維技術(shù)可以更好地了解表面的功能狀態(tài)。

實(shí)驗(yàn)方法

鈦合金改性工藝

總共分析了25件圓柱形種植體（每種樣品5件，對(duì)照樣品+4種處理工藝），種植體原料為5號(hào)商業(yè)純（CP）鈦（Ti）合金（PM國(guó)際供應(yīng)商，LLC，EEUU），即Ti-6Al-4V（TAV），其成分為90% Ti、6% Al（鋁）和4% V（釩）。樣品直徑10mm、長(zhǎng)5mm。以幾種不同的牙科常用方法處理種植體樣品的表面：

• 化學(xué)方法：接觸四環(huán)素和光敏劑；
• 物理方法：超聲處理
• 物理化學(xué)方法：碳酸氫鹽噴射拋光；

下文將予以詳述。

顯微技術(shù)

使用下列顯微技術(shù)：

1. 共聚焦顯微鏡（CM）：CM提供一種獲取物體3D圖像的便利手段。用Leica DCM 3D雙系統(tǒng)測(cè)量表面形貌和計(jì)算表面粗糙度參數(shù)。以放大率為20x、數(shù)值孔徑（NA）為0.50的共聚焦物鏡獲取圖像。
2. 原子力顯微鏡（AFM）：在室溫下用配備Nanoscope IVa控制器（Bruker）的Dimension 3100 AFM鏡頭進(jìn)行AFM研究。所有AFM圖像均用矩形硅懸臂（標(biāo)稱頂端針尖半徑為10nm、彈簧常數(shù)為15 N/m、共振頻率為145kHz）以敲擊模式記錄，掃描速率為1Hz，每張圖像512×512個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
3. 掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散X射線譜（EDS）：用JSM-7100F SEM（JEOL）和INCA 250 EDS（Oxford Instruments）研究Ti合金的表面形貌和組成。操作條件如下：加速電壓15kV、放大率200x、工作距離10mm。

用于處理種植體的牙科處理方法

探討以下典型牙科處理方法對(duì)Ti合金表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)的影響：

1. 碳酸氫鹽噴射拋光
   碳酸氫鹽細(xì)粉末（平均粒徑約150μm）噴射可以快速有效地清潔牙齒（Turbodent by Mectron）。碳酸氫鈉顆粒與熱水混合，然后加速，直至獲得極細(xì)而且規(guī)則的射流。以生理鹽水為沖洗劑，對(duì)Ti合金種植體樣品進(jìn)行噴射拋光處理1分鐘，然后用大量生理鹽水沖洗。
2. 四環(huán)素
   鹽酸四環(huán)素（Sigma-Aldrich）是一種抗生素，主要用作抑菌劑，但在特定濃度條件下可以用作殺菌劑。鹽酸四環(huán)素的粉末形式具有很強(qiáng)的腐蝕性，可用于種植體表面消毒。在本研究中，Ti合金接觸四環(huán)素/生理鹽水溶液（四環(huán)素濃度= 50mg/ml）1分鐘，然后用大量干凈的生理鹽水沖洗。
3. 超聲波
   超聲波清洗是現(xiàn)代牙科常用的技術(shù)。它用于牙齒周?chē)�和種植體周?chē)�處理。超聲波尖頭用非常薄的硬化鋼制作（Sirosonic by Sirona）。振動(dòng)誘導(dǎo)一種稱之為空腔化的現(xiàn)象，即在含有氣體或蒸氣的液體介質(zhì)中形成空腔或氣泡。此外，振動(dòng)有助于清除傷口腐肉，即分解附著于牙齒或種植體表面的微生物。以生理鹽水為沖洗劑，超聲處理Ti合金種植體樣品1分鐘（30kHz）。
4. 光動(dòng)力學(xué)療法
   光動(dòng)力學(xué)療法（PDT）需要使用光激活染料（光敏劑）。當(dāng)光敏劑在有氧條件下被激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，這些物質(zhì)可以有效地抗病毒、細(xì)菌和真菌，因此PDT可用于局部感染治療。牙科光動(dòng)力學(xué)療法涉及光敏膠的使用。本研究使用甲苯胺藍(lán)（Sigma-Aldrich），它被波長(zhǎng)為570nm的光激活。光敏膠產(chǎn)生的氧自由基與微生物細(xì)胞壁強(qiáng)烈反應(yīng)，因此對(duì)后者有毒性作用。該療法通常用于種植體周?chē)�炎治療。在本研究中，Ti合金種植體樣品以甲苯胺藍(lán)凝膠覆蓋，接著照射（FotoSan燈，570nm），靜置1分鐘（100µg/mL），然后再次照射（軟激光，906nm），最后用大量生理鹽水沖洗。

粗糙度分析

以共聚焦3D光學(xué)表面測(cè)量系統(tǒng)（Leica DCM 3D）測(cè)量表面粗糙度，使用藍(lán)光照明以獲得較高的分辨率。獲得了每一個(gè)處理過(guò)程五種不同Ti合金種植體樣品的各種表面粗糙度參數(shù)（表1）。

 

符號(hào)	單位	參數(shù)	3D參考
振幅參數(shù)
Sa	μm	高度算術(shù)平均值	ISO/DIS 25178-2 ASME B46.1
Sq	μm	高度均方根（rms）
其他3D參數(shù)
Sdar	%	展開(kāi)面積與投影面積的比率

表1：本研究分析的3D粗糙度參數(shù)。

結(jié)果與結(jié)論

共聚焦顯微鏡（CM）

獲得了Ti合金種植體對(duì)照樣品和各處理樣品的CM 2D和3D圖像數(shù)據(jù)。示例見(jiàn)下圖2。

 

A：對(duì)照

B：碳酸氫鹽噴射

C：四環(huán)素

D：超聲波

E：光動(dòng)力學(xué)療法

 

圖2A–E：Ti合金種植體樣品的共聚焦顯微鏡2D和3D形貌圖像： A）對(duì)照（未改性的氧化鈦（TiO₂）表面）；B）碳酸氫鹽噴射拋光；C）四環(huán)素處理；D）超聲處理；E）光動(dòng)力學(xué)療法處理。所測(cè)圖像的掃描面積為636µm×477µm。

原子力顯微鏡（AFM）

只獲得Ti合金種植體對(duì)照樣品的AFM 3D圖像數(shù)據(jù)。以下圖3為樣品兩處不同區(qū)域示例。

A

B

圖3A–B：Ti合金對(duì)照樣品的AFM 3D形貌圖像。在樣品的兩處不同區(qū)域拍攝3D圖像，掃描面積為10µm×10µm。每個(gè)區(qū)域的最大z范圍為：A）1,219nm（1.22µm），B）1,628nm（1.63µm）。

如上所述，圖3A最大的區(qū)域z范圍為1,219nm（1.22µm），圖3B的則為1,628nm（1.63µm），表明這兩個(gè)區(qū)域之間差異大，達(dá)25%～35%。

掃描電子顯微鏡（SEM）和能量色散X射線譜（EDS）

SEM和EDS數(shù)據(jù)顯示，碳酸氫鹽噴射拋光、四環(huán)素處理和光動(dòng)力學(xué)療法處理的Ti合金樣品，其表面污染量比對(duì)照樣品（未改性的TiO₂表面）大。但超聲處理的Ti樣品與對(duì)照樣品一樣潔凈，或比對(duì)照樣品更潔凈。

獲得了Ti合金種植體對(duì)照樣品和各處理樣品的SEM和EDS圖像數(shù)據(jù)。以下圖4為SEM圖像示例，顯示局部區(qū)域組成的EDS數(shù)據(jù)則載于表2。

 

A：對(duì)照

B：碳酸氫鹽噴射

C:

 

 

D：超聲波

 

E：光動(dòng)力學(xué)療法

 

圖4A–E：Ti合金對(duì)照樣品的SEM和EDS數(shù)據(jù)：A）對(duì)照（未改性的TiO2表面）；B）碳酸氫鹽噴射拋光；C）四環(huán)素處理；D）超聲處理；E）光動(dòng)力學(xué)療法處理。元素	表觀濃度	強(qiáng)度校正	濃度（% wt ）	σ（% wt）	濃度（% at）
C (Kα)	0.84	0.8750	3.37	0.32	11.84
Al (Kα)	1.33	0.9636	4.87	0.16	7.61
Ti (Kα)	24.46	0.9823	87.65	0.49	77.15
V (Kα)	1.12	0.9632	4.11	0.39	3.40

A）對(duì)照

元素	表觀濃度	強(qiáng)度校正	濃度（% wt ）	σ（% wt）	濃度（% at）
C (Kα)	0.31	0.7366	1.38	0.30	4.96
Na (Kα)	0.78	0.9406	2.71	0.17	5.08
Al (Kα)	1.38	0.9558	4.73	0.15	7.54
Cl (Kα)	0.73	0.9914	2.42	0.13	2.94
Ti (Kα)	25.25	0.9793	84.65	0.49	76.02
V (Kα)	1.20	0.9611	4.10	0.38	3.46

B）碳酸氫鹽噴射拋光

元素	表觀濃度	強(qiáng)度校正	濃度（% wt ）	σ（% wt）	濃度（% at）
C (Kα)	1.10	0.7748	4.18	0.35	14.02
Na (Kα)	0.70	0.9430	2.20	0.15	3.86
Al (Kα)	1.47	0.9586	4.52	0.14	6.75
Cl (Kα)	0.63	0.9878	1.89	0.12	2.15
Ti (Kα)	27.56	0.9733	83.26	0.49	70.09
V (Kα)	1.29	0.9548	3.96	0.36	3.13

C）四環(huán)素處理

元素	表觀濃度	強(qiáng)度校正	濃度（% wt ）	σ（% wt）	濃度（% at）
C (Kα)	1.01	0.6704	1.64	0.27	6.02
Al (Kα)	3.71	0.7721	5.26	0.13	6.59
Ti (Kα)	79.97	0.9864	88.67	0.37	81.60
V (Kα)	3.39	0.9713	3.82	0.23	3.30
Fe (Kα)	0.49	0.8683	0.62	0.13	0.49

D）超聲處理

元素	表觀濃度	強(qiáng)度校正	濃度（% wt ）	σ（% wt）	濃度（% at）
C (Kα)	0.48	0.7767	1.95	0.30	6.93
Na (Kα)	0.57	0.9356	1.95	0.15	3.62
Al (Kα)	1.48	0.9582	4.92	0.15	7.79
Cl (Kα)	0.49	0.9919	1.56	0.12	1.86
Ti (Kα)	26.40	0.9803	85.83	0.49	76.58
V (Kα)	1.15

E）光動(dòng)力學(xué)療法處理

表2A–E：Ti合金樣品表面局部區(qū)域組成的EDS分析數(shù)據(jù)，其中K_α為X射線測(cè)量值，σ為%wt濃度數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差：A）對(duì)照樣品；B）碳酸氫鹽噴射拋光樣品；C）四環(huán)素處理樣品；D）超聲處理樣品；E）光動(dòng)力學(xué)療法處理樣品。

粗糙度結(jié)果

粗糙度分析側(cè)重于以CM獲得的Ti合金樣品數(shù)據(jù)，CM可測(cè)定三個(gè)重要的3D粗糙度參數(shù)值： S_a、S_q及S_dar。這些數(shù)據(jù)示于下文表3。

值	對(duì)照	超聲波	光動(dòng)力學(xué)	碳酸氫鹽	四環(huán)素
Sa（µm）	1.86	0.79	1.86	1.82	1.53
Sq（µm）	2.42	1.13	2.44	2.34	1.99
Sdar（%）	20.51	5.03	23.10	20.46	15.99

表3：以共聚焦顯微鏡獲得的Ti合金樣品表面粗糙度數(shù)據(jù)。分析側(cè)重于3個(gè)粗糙度值：S_a（高度算術(shù)平均值）；S_q（高度均方根[rms]）；S_dar（展開(kāi)面積/投影面積）。

首先，光動(dòng)力學(xué)療法處理、四環(huán)素處理和碳酸氫鹽噴射拋光樣品的Sa和Sq粗糙度值與對(duì)照樣品的幾乎相同。其次，超聲處理樣品的S_a和S_q粗糙度值比對(duì)照樣品的小30%～50%。S_dar粗糙度值顯示類似的趨勢(shì)，不過(guò)噴射拋光和四環(huán)素處理樣品的S_dar值明顯小于對(duì)照樣品（參見(jiàn)以下圖5）。

圖5：表3中Ti合金種植體樣品表面粗糙度數(shù)據(jù)S_a（藍(lán)色）、S_q（紅色）和S_dar（綠色）的曲線圖，數(shù)據(jù)從CM 3D形貌圖像獲取。曲線圖顯示每種樣品表面粗糙度值的變化程度。

 

對(duì)拍攝于對(duì)照樣品（未改性）兩處不同區(qū)域的AFM圖像進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明，如果表面非常粗糙，其不同小區(qū)域的粗糙度值可能差異較大，因此AFM并非用于大面積測(cè)量的實(shí)用技術(shù)，而本研究的這類樣品需要這種測(cè)量。

粗糙度值	對(duì)照樣品區(qū)域1	對(duì)照樣品區(qū)域2
Sa（µm）	0.18	0.14
Sq（µm）	0.170	0.125
Sdar（%）	36.80	40.10

表4：以原子力顯微鏡獲取的Ti合金種植體對(duì)照樣品區(qū)域2表面粗糙度數(shù)據(jù)。分析側(cè)重于3個(gè)粗糙度值：S_a（高度算術(shù)平均值）；S_q（高度均方根[rms]）；S_dar（展開(kāi)面積/投影面積）。

如上文表4所示，兩個(gè)區(qū)域的S_dar值相差約10%，S_q值相差約35%，S_a值相差約30%。另一方面，AFM圖像顯示z范圍差值超過(guò)1µm的峰和山，這對(duì)于AFM分析而言屬于大差異，會(huì)導(dǎo)致圖像中存在偽影，即可能由于頂端掃描樣品時(shí)碰觸表面而產(chǎn)生的“條紋”�？偠�言之，AFM圖像結(jié)果取決于樣品形貌和力學(xué)性能、反饋回路增益、掃描速率等。

總結(jié)和結(jié)論

目前臨床上使用的Ti合金牙種植體具有各種各樣的表面特性（包括結(jié)構(gòu)特征和化學(xué)性質(zhì)）。上述表面改性保留種植體的關(guān)鍵物理性質(zhì)，只涉及其最外層表面，最終目標(biāo)為實(shí)現(xiàn)所需的生物反應(yīng)。以上介紹了不同物理化學(xué)、物理和化學(xué)表面改性方法的優(yōu)劣。這些方法將幫助我們更好地了解種植體材料表面改性如何影響骨-種植體界面，以及如何在成功治療種植體周?chē)�炎（種植體周?chē)�牙質(zhì)組織感染）后的愈合過(guò)程中影響種植體骨整合優(yōu)化方法的制定。目前尚未完全清楚表面粗糙度和化學(xué)性質(zhì)對(duì)骨整合的影響程度。具有最佳臨床效果的理想粗糙度仍是個(gè)未知數(shù)[20–23]。

對(duì)于用四環(huán)素和光動(dòng)力學(xué)療法改性的樣品，其形態(tài)受到鈦合金析出的金屬間顆�；瘜W(xué)侵蝕的影響。對(duì)于用噴射拋光和超聲處理改性的樣品，機(jī)理主要與力學(xué)相關(guān)。噴射拋光和光動(dòng)力學(xué)療法處理樣品的表面粗糙度與對(duì)照樣品相似（基于S_a、S_q和S_dar值）。超聲和四環(huán)素處理樣品的表面粗糙度低于對(duì)照樣品。事實(shí)上，超聲處理可使表面明顯變得平坦。

碳酸氫鹽噴射拋光樣品的污染程度最大（鹽殘留），其次為四環(huán)素和光動(dòng)力學(xué)療法處理樣品，超聲處理樣品污染最少。由于接觸到鹽（碳酸氫鹽）或化合物（四環(huán)素或甲苯胺藍(lán)），噴射拋光、四環(huán)素及光動(dòng)力學(xué)療法處理的Ti合金樣品污染程度最大，這是顯而易見(jiàn)的。超聲處理的樣品與對(duì)照樣品一樣潔凈，或比對(duì)照樣品潔凈，不過(guò)也存在少量的鐵（Fe），這些鐵可能來(lái)自超聲處理所用的鋼探頭。

可以通過(guò)合理使用這些牙科處理方法，最大可能提高種植體周?chē)�炎愈合過(guò)程Ti合金種植體與骨結(jié)合的概率。也許可以先使用光動(dòng)力學(xué)療法或碳酸氫鹽噴射拋光（頻率較低，比如20kHz，功率亦較低）維持種植體的表面粗糙度，然后施以短暫輕微的超聲處理，或可有效凈化表面。

參考文獻(xiàn)

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致謝

本文作者衷心感謝徠卡顯微系統(tǒng) James DeRose 對(duì)結(jié)果作出的有益討論和評(píng)論，以及對(duì)手稿的校對(duì)工作，還感謝 Aranzazu Villuendas (CCiTUB) 對(duì) SEM 結(jié)果作出的有益討論。