應(yīng)用實例 | 顯微成像技術(shù)在干細胞研究中的應(yīng)用

干細胞涉及到個體發(fā)育、器官移植、延緩衰老、癌癥治療等方方面面。單個的干細胞是如何分裂、分化成新的細胞、組織或器官呢？在成體中，干細胞又是如何完成細胞修復(fù)更新的使命呢？在下面的文章中，我們將介紹如何借助共聚焦、雙光子等顯微成像分析技術(shù)一一解決在干細胞研究中的這些問題。

激光共聚焦掃描顯微鏡可以精確可控的進行的光學(xué)切片，清晰呈現(xiàn)細胞每一層的亞結(jié)構(gòu)信息，這對研究研究蛋白定位、細胞器分化等非常重要。如需研究氯胺酮(Ketamine)對iPSC誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響，即可采用共聚焦呈現(xiàn)清晰圖像。

圖1 氯胺酮(Ketamine)對iPSC誘導(dǎo)的神經(jīng)元線粒體形態(tài)的影響。

（Ketamine Causes Mitochondrial Dysfunction in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived NeuronsHiroyuki Ito, Tokujiro Uchida, Koshi Makita. PLoS One. 2015; 10(5): 2015 May 28. doi: 10.1371/journal.pone.0128445）

這種藥物刺激實驗，往往需要在活細胞中加入藥物并實時跟蹤。那么如何保持細胞的活性呢？很簡單，只需要將細胞培養(yǎng)環(huán)境重現(xiàn)在顯微鏡上即可，可稱之為Live on the Stage。目前徠卡LAS X軟件系統(tǒng)提供從采集拍攝到分析一站式服務(wù)，而且還可以是在線控制細胞生長的溫度、濕度、CO2等各種環(huán)境條件。下圖是常見的大箱式培養(yǎng)裝置及小型細胞培養(yǎng)箱：

圖 2 顯微鏡上常用的培養(yǎng)裝置。（左圖：大箱式培養(yǎng)裝置，整個顯微鏡環(huán)境更穩(wěn)定；右圖：小型培養(yǎng)裝置，便于操作）

有些細胞形態(tài)甚至命運的變化需要很長時間才能體現(xiàn)出來，那么長時間培養(yǎng)拍攝過程中焦面的穩(wěn)定尤為重要。德國品質(zhì)保證了徠卡顯微鏡本身超強的穩(wěn)定性，同時徠卡還提供AFC（Adaptive Focus Control，自動焦面控制系統(tǒng)）實時追蹤穩(wěn)定細胞培養(yǎng)皿底與物鏡之間的物鏡距離，硬件上保證焦面的穩(wěn)定；但是由于細胞生長自身引起的焦面變化怎么辦呢？徠卡軟件Best Focus，提供五種算法，無論明場還是熒光成像，均可實時最終目標(biāo)細胞。有了這些硬件、軟件焦面穩(wěn)定保障，再也不用擔(dān)心細胞不見了。

干細胞研究中常常設(shè)計多個基因或多種刺激條件，很顯然每次只對一個樣品成像不僅效率低下而且實驗重復(fù)性差。此時即可采用徠卡的多點掃描成像（Mark and Find，適用于每個點成像要求一致，樣品點不是很多）或高內(nèi)涵成像（HCS，適用于多點、多孔板、負責(zé)實驗）。如下圖所示，HCS不僅可以對多孔板的多個孔自動成像，還可以對不同孔采用不同的成像條件，滿足各種復(fù)雜實驗需求。

圖3 HCS高內(nèi)涵成像。

干細胞成像研究后期均要進入體內(nèi)研究，目前已有多重方法追蹤單個干細胞的最終分化命運，如常見的R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因策略。這種方法涉及到CFP、GFP、YFP及RFP四種熒光蛋白的表達， 而這四種熒光蛋白的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜（圖5，左圖）非常接近，特別是GFP和YFP，非常容易串色，對共聚焦顯微鏡提出了苛刻的要求。徠卡采用專利的棱鏡分光，狹縫檢測系統(tǒng)，可自由調(diào)節(jié)檢測器對熒光信號的接收范圍，最大效率收集熒光信號，避免串色；同時，在分光鏡上突破傳統(tǒng)的二向色鏡，不在受限于濾鏡鍍膜限制，采用完全自由的AOBS系統(tǒng)（圖5， 右圖），配合光譜式檢測器，完全實現(xiàn)自由檢測，最大程度上避免熒光串色，直接得出實驗結(jié)果，而無需再采用軟件串色分離等后期圖像處理。

圖4 R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因原理及應(yīng)用。

上圖：R26R-Confetti 轉(zhuǎn)基因原理：編碼四種熒光蛋白的Brainbow2.1被插入到的Rosa26位點處，Cre激活后，neomycin被剪切掉，四種熒光蛋白隨機表達在不同的細胞中且在細胞中的定位有所不同，GFP核定位，CFP特異性表達在細胞膜，另外兩種則是胞質(zhì)定位。

下圖：多種組織中利用R26R-Confetti追蹤干細胞命運。標(biāo)尺: 50 um; Pancreas/Kidney/Liver中標(biāo)尺為100 um。

（Cell. 2010 Oct 1;143(1):134-44. doi: 10.1016/j.cell.2010.09.016.

Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Snippert HJ1, van der Flier LG, Sato T, van Es JH, van den Born M, Kroon-Veenboer C, Barker N, Klein AM, van Rheenen J, Simons BD, Clevers H.）

圖5 CFP、GFP、YFP及RFP四種熒光蛋白的激發(fā)和發(fā)射光譜及AOBS系統(tǒng)。

干細胞生長的微環(huán)境對于干細胞的功能、命運至關(guān)重要，無論是體外模擬干細胞生長的3D環(huán)境還是直接觀察體內(nèi)的干細胞，在成像時均需要較高的穿透深度和靈敏度，此時多光子顯微鏡因為具有更高的穿透性、更低的光毒性，比常規(guī)共聚焦顯微鏡有更大的優(yōu)勢。結(jié)合高精度載物臺及軟件記憶功能，可實現(xiàn)在體（In vivo）干細胞分裂、分化的長時間跟蹤。如在跟蹤小腸隱窩單細胞命運的實驗中，不能把實驗小鼠放在顯微鏡載物臺上連續(xù)培養(yǎng)拍攝跟蹤，那么如何跟蹤單個細胞的命運？如何能在下一個實驗時間點準(zhǔn)確的找到原來的拍攝位置呢？其實可以借助顯微鏡上配的高精度電動載物臺及軟件的記憶功能，以小鼠的血管等有顯著結(jié)構(gòu)的部位作為參考點，順利在每次拍照中找到原來的拍攝視野（圖 6）。這樣不僅可以利用雙光子顯微鏡重現(xiàn)整個隱窩中干細胞的三維立體分布

還可以將多天長時間拍攝的圖片連接起來還原單個干細胞的命運。

圖6 追蹤還原體內(nèi)成像的拍攝視野。a）成像視野的相對坐標(biāo)可以被軟件記錄并存儲調(diào)用；b)小鼠的血管結(jié)構(gòu)可以用做參考點；c)  成像視野被找到并拍攝，標(biāo)尺20 um。

(Nature. 2014 Mar 20;507(7492):362-5. doi: 10.1038/nature12972. Epub 2014 Feb 16.)

顯微成像技術(shù)使得干細胞的分化、發(fā)育等過程變得實時可見。本文中囿于篇幅限制沒有提及的超高分辨率顯微成像技術(shù)更能在納米水平清晰揭示干細胞中亞結(jié)構(gòu)的變化，相信能為干細胞研究提供另一把利器。