徠卡學(xué)院 | 光片顯微鏡的前世今生

光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）的概念產(chǎn)生于1903年，但此后很長(zhǎng)時(shí)間并無(wú)太多發(fā)展。上世紀(jì)九十年代，華盛頓大學(xué)的Francis Spelman實(shí)驗(yàn)室為了對(duì)小鼠毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和耳蝸的其他特性進(jìn)行定量測(cè)量，發(fā)展了一系列實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)室研究人員受到前人使用側(cè)向光片照明觀察表面結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，發(fā)明了正交平面熒光光學(xué)切片裝置（orthogonal plane fluorescence optical sectioning, OPFOS），并第一次獲得了整個(gè)耳蝸的清晰熒光圖像(1) (2) (3)。2004年，SPIM（Single plane illumination microscopy ）文章的發(fā)表大大促進(jìn)了光片顯微鏡的發(fā)展和使用(4)，文章強(qiáng)調(diào)了其用于胚胎發(fā)育研究的實(shí)用性，并給出了青鳉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞搏動(dòng)以及果蠅胚胎發(fā)育長(zhǎng)時(shí)間成像的熒光圖像。 2010年，在第一屆光片熒光顯微鏡研討會(huì)上，研究者們決定將LSFM作為這一類顯微鏡的統(tǒng)一名稱(5)。后續(xù)又出現(xiàn)了很多形式的光片顯微鏡，如掃描光片(6)、雙光子掃描光片(7)和bessel beam(8)、lattice(9)等新式光片顯微鏡。這些方法不斷改善光片顯微鏡的成像分辨率、穿透深度和成像視野，以期滿足生物學(xué)發(fā)展的需要。

光片顯微系統(tǒng)成像原理

光片顯微系統(tǒng)使用一層光束從樣品側(cè)面激發(fā)熒光樣品，使用CCD或SCMOS進(jìn)行檢測(cè)，照明光路和熒光檢測(cè)光路互相垂直。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面，不存在離焦激發(fā)，可以自動(dòng)獲得光學(xué)切片，從而將光漂白和光學(xué)損傷降到最低。光片顯微系統(tǒng)使用CCD或SCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動(dòng)樣品使入射光束激發(fā)不同的平面，可以很容易又非�？焖俚牡玫秸麄�(gè)組織的3D圖傳統(tǒng)共聚焦的激發(fā)和檢測(cè)是同一個(gè)方向，整個(gè)照射區(qū)域都處于被激發(fā)狀態(tài)，沒有被檢測(cè)的區(qū)域經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的照射易被淬滅，無(wú)法保證幾天的記錄；另外共聚焦使用點(diǎn)掃描成像，速度相對(duì)較慢。

光片熒光顯微鏡與共聚焦顯微鏡的區(qū)別

2015年，Leica推出了自己的光片系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用獨(dú)特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發(fā)光束從左右兩個(gè)方向入射到樣品上，照明均勻，保證了細(xì)胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點(diǎn)可使樣品在該系統(tǒng)中保持其生物活性，完成數(shù)小時(shí)乃至數(shù)天的長(zhǎng)時(shí)間活體生物培養(yǎng)及成像。另外，Leica光片系統(tǒng)以共聚焦為基礎(chǔ)，可以實(shí)現(xiàn)與共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用，完成光激活、光轉(zhuǎn)換等操作及后續(xù)追蹤的實(shí)驗(yàn)。

Leica光片顯微系統(tǒng)常見應(yīng)用

• 胚胎與小型生物(如模式動(dòng)物斑馬魚、線蟲、果蠅等，植物擬南芥等)發(fā)育過程中的快速三維成像，例如：細(xì)胞遷移、心臟及血管發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育等。

• 三維細(xì)胞培養(yǎng)、球體和囊腫、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)的實(shí)時(shí)成像。

• 結(jié)合共聚焦或雙光子激光顯微鏡，完成光學(xué)刺激與追蹤的功能，觀察和實(shí)驗(yàn)方式更為靈活多樣。

1. 快速3D成像

斑馬魚血管系統(tǒng)3D重構(gòu)

2. 活體快速長(zhǎng)時(shí)間3D成像，捕捉整個(gè)動(dòng)態(tài)過程

高速成像：斑馬魚跳動(dòng)的心臟

果蠅背部閉合過程

3. 唯一可以結(jié)合共聚焦和光片的系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)光學(xué)操作的后續(xù)追蹤

斑馬魚神經(jīng)元光轉(zhuǎn)換(Kaede)后，持續(xù)記錄該細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)

斑馬魚尾部，光轉(zhuǎn)換(Kaede，405 nm)后細(xì)胞去修復(fù)被多光子激光造成的損傷部位

長(zhǎng)時(shí)間的圖像采集需要維持樣品的活性，Leica光片系統(tǒng)可加載孵育裝置，為樣品提供良好的生長(zhǎng)條件，保持活性。另外整個(gè)系統(tǒng)的開放性很高，有更多可操作的空間。

參考文獻(xiàn)

1.       Voie AH, Burns DH, Spelman FA.(1993) Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. Jun;170(Pt 3):229-36.

2.       Voie AH, Spelman FA. (1995) Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Comput Med Imaging Graph. Sep-Oct;19(5):377-84.

3.       Voie AH. (2002) Imaging the intact guinea pig tympanic bulla by orthogonal-plane fluorescence optical sectioning microscopy. Hear Res. Sep;171(1-2):119-128. Erratum in: Hear Res. 2003 Jul;181(1-2):144.

4.       Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., and Stelzer, E. H. (2004) Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science (New York, N.Y 305, 1007-1009

5.       Reynaud EG, Tomancak P. (2010) Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. Aug;5(8):798-804. doi: 10.1002/biot.201000177

6.       Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., and Stelzer, E. H. (2008) Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science (New York, N.Y 322, 1065-1069

7.       Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., and Fraser, S. E. (2011) Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature methods 8, 757-760

8.       Planchon, T. A., Gao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., Galbraith, J. A., Galbraith, C. G., and Betzig, E. (2011) Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nature methods 8, 417-423

9.       Chen, B. C., Legant, W. R., Wang, K., Shao, L., Milkie, D. E., Davidson, M. W., Janetopoulos, C., Wu, X. S., Hammer, J. A., 3rd, Liu, Z., English, B. P., Mimori-Kiyosue, Y., Romero, D. P., Ritter, A. T., Lippincott-Schwartz, J., Fritz-Laylin, L., Mullins, R. D., Mitchell, D. M., Bembenek, J. N., Reymann, A. C., Bohme, R., Grill, S. W., Wang, J. T., Seydoux, G., Tulu, U. S., Kiehart, D. P., and Betzig, E. (2014) Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science (New York, N.Y 346, 1257998