徠卡課堂 | 徠卡，助你駕馭基因編輯的隱形剪刀 ——顯微操作技術在基因編輯中的應用

本文將大致回顧小鼠轉基因領域的顯微操作技術，包括CRISPR/Cas9技術，旨在對這類客戶所用的工作流程和術語進行介紹。此外，還針對有用的顯微操作系統(tǒng)配置提供一些建議。

顯微操作技術概述

圖1：CRISPR/Cas9、原核注射和胚胎干細胞移植技術的粗略比較。更多詳情請參閱下文。

小鼠胚胎早期發(fā)育階段

 

圖2：小鼠胚胎早期發(fā)育階段示意圖（夜間受精，早上注射。）（來源：http://dev.biologists.org/content/137/6/859）

圖3：原核階段示意圖（透明帶標為紅色）

 

圖4：囊胚結構示意圖

顯微操作技術

原核注射（PNI）和胚胎干細胞移植（ESI）

不管是否涉及CRISPR（或者TALEN、ZFN（見第4章）），都要使用原核注射/受精卵注射技術或胚胎干細胞注射技術。這兩種技術是成熟的主流技術，在世界范圍內(nèi)使用：

原核注射

受精后約12小時，出現(xiàn)了一個卵子原核和一個精子原核（圖2）。在原核融合為一體并構成受精卵細胞核之前，將DNA注入原核階段受精卵內(nèi)的一個原核中，直徑約80-100µm。注射的靶DNA隨機整合到基因組DNA。方向和拷貝數(shù)不可預測，即這是一種非靶向技術，快速直接地獲得感興趣的轉基因小鼠概率非常有限。

圖5：PNI。以固定毛細管固定PN階段的小鼠胚胎（左側）。經(jīng)由毛細管將溶于緩沖液的少量DNA注入其中一個原核（右側）�？煽匆姳蛔⑸涞脑�核發(fā)生膨脹。圖片以徠卡DIC采集 。

 

圖6：PN 注射過程DNA 隨機非靶向整合到基因組中

典型的PNI系統(tǒng)設置：

-DMi8：手動、電動部件可供選擇

-透射光軸； S28聚光鏡及微分干涉差

-5/10倍物鏡（FLUOTAR或N PLAN）用于大致觀察

-20倍、40倍長工作距離物鏡。40倍物鏡用于注射

-3板載物臺（固定載物臺的物體導桿妨礙顯微操作器�。�

-精選顯微操作器（優(yōu)選直接注入的毛細管：平角有助于盡可能降低胚胎受損程度）

-氣壓式手動顯微注射儀用于固定（逆時針轉動產(chǎn)生的負壓可固定胚胎）

- FemtoJet®顯微注射儀（少量液體，壓力x 時間 = 體積）

-根據(jù)實驗室偏好選擇樣品載體（玻璃底器皿、蓋玻片等）

PN注射通常在室溫下借助放大400倍的微分干涉差顯微鏡（一些還使用IMC）完成。（一些情況下還將胚胎冷卻至10°C，使質膜更僵硬以方便注射）

胚胎干細胞移植

胚胎干細胞注入囊胚（圖4），囊胚階段從第3.5天開始，約128個細胞。內(nèi)細胞群由多能性胚胎干細胞組成，也就是說它們可以發(fā)育并分化為不同類型細胞。有時注入八細胞階段的桑椹胚胎 （圖9）。

圖7：ESI。以固定的毛細管（左側）固定小鼠胚囊。經(jīng)由毛細管將基因修飾的胚胎干細胞注入囊胚腔（右側）。注射在內(nèi)細胞群外滋養(yǎng)外胚層細胞之間完成。圖片以徠卡AM6000上的徠卡DIC采集。

注入的胚胎干細胞與內(nèi)細胞的胚胎干細胞發(fā)育為小鼠。這是一只嵌合體小鼠，其細胞/器官來源于注入的胚胎干細胞（雄性）和胚囊（雄性/雌性）。

目的基因的編輯在胚胎干細胞移植注射前完成，這耗時大約3-4個月 ，直至攜帶基因組DNA靶序列的ES細胞克隆被選定。大部分時間里修飾只出現(xiàn)在一個等位基因，意味著嵌合體是雜合的。產(chǎn)生的克隆在1個等位基因上攜帶靶突變（在兩個等位基因上的概率非常低）。這項技術允許插入大約10-20 kB的DNA。靶向突變所用方法為同源重組。

 

圖8：ES細胞DNA的靶向整合/突變

1）利用分子生物學技術創(chuàng)建含有靶DNA以及新霉素抗性位點、翻轉酶識別位點（FTR）和CRE重組酶識別位點（loxP）的DNA。

2）通過轉染方式將靶DNA注入ES細胞。重組體通過同源重組整合到基因組DNA。

3）往細胞培養(yǎng)物中添加新霉素（一種抗生素），以選擇產(chǎn)生的ES克隆。只有具備新霉素抗性的克隆才能存活生長。挑出這些克隆繼續(xù)培養(yǎng)。

4）添加翻轉酶（一種切割DNA并將其重新結合的重組酶），消除新霉素抗性。

5）通過轉基因小鼠與另外一只轉基因“CRE小鼠”交配，loxP位點可以條件性敲除。表達CRE重組酶的小鼠通常具有類似組織特異性的表達，這種特異性的表達使小鼠具備例如在大腦中的基因的靶向敲除。

經(jīng)由同源重組及ES細胞注射的靶向突變，多年來已成為“金標準”。與CRISPR相比，不足之處包括：

• 載體準備時間長

• 選擇ES細胞克隆費時

• 載體克隆和ES細胞工作耗時約3個月

• 生成純合子小鼠耗時約1年

如上所述，在大約 99% 的案例中，產(chǎn)生的嵌合體是雜合的。最終目的是獲得用于研究的純合子動物。

這是一個費時費力的交配、篩選過程：

1)    胚囊（♀或♂）+ ES細胞（♂）產(chǎn)生♂嵌合體。目的是獲得生殖細胞中具有ES細胞修飾的嵌合體

2)    ♂ 雜合嵌合體 + WT ♀產(chǎn)生雜合F1（♂或♀）

3)    雜合♂ + 雜合♀ 產(chǎn)生純合F2代

純合子小鼠的兩個等位基因上均攜帶突變。最終獲得這些有價值的動物耗時1年左右！

典型的ES移植系統(tǒng)設置：

-DMi8：手動、電動部件可供選擇；

-透射光軸；S28聚光鏡

-DIC為非必需。胚胎在胚囊階段已經(jīng)足夠大，其細節(jié)容易觀察。

- 5/10倍；20倍；40倍長工作距離物鏡；較小NA = 較大景深

-3板載物臺（固定載物臺的物體導桿妨礙顯微操作器�。�

-精選顯微操作器（優(yōu)選直接注入的毛細管：平角有助于盡可能降低胚胎受損程度）

-氣壓式手動顯微注射儀用于固定

-油壓式或油壓式帶齒輪手動顯微注射儀用于注射ES細胞。

ES細胞注射通常在室溫下借助放大200倍的DIC/ IMC/PH顯微鏡完成。

ESI的差異在于將 ES細胞注入8細胞階段的胚胎中（圖9）。這項操作通常使用鈍端毛細管完成，以免損傷細胞。激光器（Hamilton-Thorne，Octax或Piezo壓電式破膜系統(tǒng)）可幫助鈍端毛細管穿過透明帶和膜。

圖9：ESI注入8細胞階段的胚胎。鈍端毛細管

圖10：EMBL轉基因過程中使用的DMi8、Eppendorf TransferMan 4r顯微操作器和PiezoXpert壓電破膜儀。以鈍端毛細管進行胚囊注射。DIC

用于小鼠轉基因的CRISPR/Cas 9技術

用于小鼠轉基因的CRISPR/Cas9技術為靶向突變提供了工具（如ESI），但無需繁雜的ES處理工作！（當然CRISPR也可以用于ES細胞突變）。

轉錄激活子樣效應因子核酸酶（TALEN）技術是一種更為成熟的技術。TALE（轉錄激活子樣效應因子）是結合DNA特定序列的蛋白質。TALE與核酸酶融合即為TALEN，這是一種具有高度特異性的DNA剪刀。TALEN使雙鏈斷裂。修復機制導致靶基因缺失或敲除。

目前，CRISPR技術相對于TALEN技術而言并不昂貴。

另外一種基因組編輯技術是鋅指核酸酶技術，它通過在用戶指定位置上造成DNA雙鏈斷裂而發(fā)生作用。

CRIPR/Cas9技術所用的工具如下所示：

向導RNA：這種RNA與用戶修飾的靶DNA同源。向導RNA與DNA上的大約20個核苷酸結合。RNA鏈的其余部分用于結合Cas9核酸內(nèi)切酶。需要對20個結合的核苷酸進行設計，以找到/發(fā)現(xiàn)靶序列。

Cas9核酸內(nèi)切酶：切割效率高，有時甚至切割兩個等位基因。

將向導RNA和Cas9蛋白（或Cas9的DNA或mRNA）注射到受精卵里，Cas 9切割DNA，修復機制開始起作用。該方法在第一代小鼠體內(nèi)產(chǎn)生點突變的概率高。更先進的技術是注射攜帶靶基因或突變的同源DNA以及向導RNA/Cas9混合體。經(jīng)由同源重組插入DNA相當有效。

小鼠轉基因用CRISPR/Cas9的優(yōu)點/缺點：

優(yōu)點：

+  Cas  9切割效率非常高，有時甚至切割兩個等位基因，即可獲得同源1代小鼠！

+ 無需繁瑣的ES細胞處理工作

+ CRISPR/Cas9技術不依賴于小鼠（而PNI和ESI則依賴），即它也可用于其他物種 （豬等）。

缺點：

-  迄今已公布的最長插入片段為3kB

-  目前l(fā)ox P條件性敲除效率低

需要注射高濃度黏性分子（如RNA、蛋白質），會堵塞毛細管。因此需要更粗的毛細管，而且要求平角注射！

 

Cas9高效率地剪切DNA,DNA的修復機制造成了點突變。

 

*注射gDNA+Cas9+同源的DNA

 

圖11：CRISPR/Cas9技術

典型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)設置

與PN注射設置相同，以下除外：

將濃度較高的黏性CRISPR成分（RNA、蛋白質）注入受精卵時需要使用較粗的毛細管。這些毛細管結構筆直，內(nèi)徑較大，大多數(shù)實驗室均制作。

因此極力建議沿著真正的平角方向注射（見圖10），以避免胚胎受損。

此外，使用Piezo壓電式破膜系統(tǒng)，可以更輕松地穿過透明帶，尤其是質膜。

顯微操作器水平移動，將目標片段注入懸浮細胞內(nèi)

圖12：受精卵注射過程的注射角度。顯微操作器水平移動，零度角注射可使胚胎受損程度較輕。注射角度大于10° 將導致受精卵出現(xiàn)較大的“洞”，使其存活率降低。

徠卡顯微操作器的移動角度可調(diào)，也就是說，即便角度較陡，注射角度本身也是零度角！

這是徠卡顯微操作器的一大優(yōu)點：黏性的向導RNA和cas9蛋白混合物所需的較粗毛細管（減少堵塞）可以沿著零度角方向注射！

其他實驗室設備（轉基因實驗室）

-立體顯微鏡是選擇和控制胚囊、ES細胞和毛細管必不可少的工具。（如TL5000、M80、Rottermann contrast）

圖13：M80及TL5000 Ergo。PN注射后的雙細胞階段。

• DIC專用玻璃底器皿，一些實驗室使用大號蓋玻片

• 毛細管：若干公司提供即買即用產(chǎn)品。許多轉基因實驗室自己制作毛細管。

直線注射CRISPR/Cas9需要使用內(nèi)徑足夠大的毛細管。轉基因專家自己制作“高級”毛細管以達到最高效率。

需要工具：

• 拉針器（如Sutter、Narishige）

• 磨具（用于毛細管拉拔后加工）

• 顯微拉制儀（用于彎曲毛細管）

上述顯微操作器：

• 徠卡機械式顯微操作器：轉基因領域贊譽頗高的顯微操作器類型。角度可調(diào)，即使毛細管角度較陡，也可獲得零度注射角。穩(wěn)健可靠，負載能力強，持久耐用。用戶眾多。當移動徠卡顯微操作器的控制桿時，可以感覺到毛細管觸及胚胎。

• Eppendorf TransferMan4r：全自動顯微操作器，具有許多附加功能�？梢云浇亲⑸�。氣壓式、油壓式、油壓式帶齒輪和Femtojet手動顯微注射器經(jīng)常用于其他顯微操作器。性能最優(yōu)，價格最高。

• Narishige：新式Takanome顯微操作器無平角操作功能。配備MOM-202D和MON-202D后可以平角操作。油壓式顯微操作器當然首屈一指。注射器：IM 9B、IM 9C、IM-11、IM300。

防震：在很大程度上取決于注射室位于地下室還是高層建筑的十層（不管需要與否）。采用被動（鐵板、沉重石桌、網(wǎng)球等）和主動設置。

徠卡DMi8轉基因系統(tǒng)特點

•    高度模塊化的倒置研究顯微鏡 – 根據(jù)客戶需要提供手動/電動組件

•    載物臺高度低 – 工效學效果更佳，胚胎操作更安全

•    顯微鏡穩(wěn)定 – 振動較少

•    完美的徠卡光學系統(tǒng)！

•    最佳DIC！– 原核可視

•    智能自動化 – 單擊按鈕便可使用/停用光學部件

•    集成調(diào)制和相襯 –  標準物鏡沒有調(diào)制器/PH圈

•    微型徠卡顯微操作器操作臺（位置靠近顯微鏡，因此靠近光軸/試樣）

•    徠卡操作器總是零度角注射！

•    徠卡顯微操作器：可靠、精確、知名度高

與Eppendorf和Narishige顯微操作器兼容

參考文獻

1. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering

2. Haoyi Wang, Hui Yang, Chikdu S. Shivalila, Meelad M. Dawlaty, Albert W. Cheng, Feng Zhang, Rudolf Jaenisch, Cell 153, 910-918, May 9, 2013

3. -Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system

4. Albert W Cheng, Haoyi Wang, Hui Yang, Linyu Shi, Yarden Katz, Thorold W Theunissen, Sudharshan Rangarajan, Chikdu S Shivalila, Daniel B Dadon and Rudolf Jaenisch, Cell Research (2013) 23:1163–1171. doi:10.1038/cr.2013.122; published online 27 Aug 2013